蓝白斑筛选的原理是什么?

如题所述

蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。
野生型大肠杆菌(E.Coli)产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后,突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法,是根据载体的遗传特征筛选重组子,主要为α-互补与抗生素基因。蓝白斑筛选在指示培养基上,未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长,重组质粒的菌落是白色的,非重组质粒的菌落是蓝色的,以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。
一些载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片段的编码区,该编码区中含有多克隆位点(MCS),可用于构建重组子 。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性,但它们同时存在时,α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地破坏α片段的编码,使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,称为蓝白斑筛选。

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第1个回答  2021-06-24

一些载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片段的编码区,该编码区中含有多克隆位点(MCS),可用于构建重组子。

这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性,但它们同时存在时,α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样,lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地破坏α片段的编码,使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,称为蓝白斑筛选

缺点

由于多种原因,一些白色菌落可能不包含所需的重组质粒。连接的 DNA 可能不是正确的或未正确连接的,并且某些线性化载体可能被转化,其末端“修复”并连接在一起,从而不会产生 LacZα,也不会形成蓝色菌落。

突变也会导致 α 片段不被表达。完全没有载体的菌落也会出现白色,有时可能会在抗生素后显示为卫星菌落已用完。

蓝色菌落也可能包含插入物。当插入片段与 LacZα 基因“符合读框”且插入片段中不存在终止密码子时,就会发生这种情况。

以上内容参考 百度百科-蓝白斑筛选

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第2个回答  2017-11-23

首先我们需要知道是什么让菌落显现出蓝白两色的。其实呢,白色吧,就是菌落本身的颜色,汗。是真的,看一下平板就知道了,菌落就是白色的。那蓝色呢?蓝色确实是比较神奇的。蓝色其实是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase enzyme)分解X-gal产生的产物的颜色。X-gal?什么鬼。它的全名是5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(不要试图记住全名了,为了记住它,小编已经阵亡)。产物又是啥,产物是一种叫做5-溴-4-氯靛兰的蓝色东东。
大肠杆菌本身是能够表达β-半乳糖苷酶的(乳酸存在的前提下),所以正常的大肠杆菌无法进行蓝白斑筛选,有乳酸存在的条件下,所有菌落都会分解X-gal产生蓝色。能够用来进行蓝白斑筛选的菌株,我们管之叫作为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。缺陷就意味这不正常。也就是说能够进行蓝白斑筛选的菌株内的β-半乳糖苷酶的表达是不正常的(小编你好啰嗦)。β-半乳糖苷酶可以拆分成两个部分,N端和C端。β-半乳糖苷酶缺陷型菌株的基因组中含有表达β-半乳糖苷酶C端的基因,而N端(一个146个氨基酸的短肽,即α肽链)的基因被安放到了表达的载体中。N端基因经过改造,中间插入多克隆位点。

第3个回答  2017-11-22

蓝白斑筛选利用的是乳糖操纵子系统。野生大肠杆菌具有完整的乳糖操纵子系统,能把 x-gal变成蓝色。实验室用做转化用的大肠杆菌缺乏乳糖操纵子系统中的lac-Z基因。这个基因被普遍设计在了各种各样的载体上,并且在lac-Z基因编码区中间涉及了多克隆位点,以供外源基因插入。而外源基因的插入又会导致Lac-Z基因被破坏。因此,没有受到质粒转入的感受态菌会被抗生素杀死,得到了空质粒的大肠杆菌不会被杀死,而且能够将 x-gal变成蓝色。只有得到了具有插入片段的质粒的大肠杆菌不会被抗生素杀死,且不能分解X-gal,于是长出白斑。

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第4个回答  2020-12-26

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