有没有高人能告诉我蓝白斑筛的步骤，原理。谢谢。 有加分

Question

如题所述

Answer 1

在这之前先说一下做蓝白斑筛选必备条件
（1）首先定义
LacZ：B(beta,打不出来，下同)-半乳糖苷酶
LacZ'：含有B-半乳糖苷酶的启动子和5‘端的编码的a肽链。
那么LacZ'是没有功能的（是指能表达没有功能的蛋白质），只有和失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶重新互补形成完整的B-半乳糖苷酶后才具有功能，它能将底物Xgal（5-溴-4-氯-3吲哚-B-半乳糖苷）水解，形成一种蓝色化合物，菌落呈蓝色；其靠近5‘端有多克隆位点，当插入外源目的基因后将会影响该基因的功能，导致无法形成完整功能的B-半乳糖苷酶而不能水解IPTG底物，菌落呈白色。
通俗易懂的说法就是LacZ'是左半边，失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶是右半边，组合在一块形成有功能的酶。
（2）明白以上这点，我们再往下说。
1.一般来说，做蓝白斑，质粒载体上有LacZ'
2.Lac I，是LacZ'的抑制基因，表达的阻遏蛋白和LacZ'上的操作子区结合将会阻遏LacZ'基因的表达，当有诱导物，IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）与阻遏蛋白结合后，将使阻遏蛋白脱离操作子，从而使LacZ'正常表达。
3.抗药基因，如Amp，用于筛除未将载体转入了的宿主细胞，这是前提，否则鉴定是没有意义的
4.而宿主应该具备的条件是具有失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶的一种突变体，即前文说的右半边
（3）步骤如下：
1.将目的基因插入LacZ'靠近5‘端有多克隆位点，是否成功插入有待蓝白斑筛选鉴定。
2.通过一定的方法，如CaCl2诱导法将目的基因转入宿主菌（失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶的一种突变体）
3.将宿主菌至于含有IPTG，Xgal，以及抗生素Amp固体培养基中培养
4.形成白色菌斑，说明目的基因插入了多克隆位点，导致LacZ’的基因功能受到影响，与失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶组合后不能水解Xgal，菌落呈白色。形成蓝色菌斑，说明目的基因没有成功插入多克隆位点，LacZ'功能正常，与失去正常氨基端（5'端）的B-半乳糖苷酶组合后能水解Xgal，生成蓝色化合物，菌斑呈蓝色。
5.这里不存在由于质粒未能成功转入宿主而导致的Xgal不水解形成白色菌落的可能，因为未能成功导入质粒的宿主菌将会因为缺乏Amp抗性而被杀死。追问

（1）段里面的IPTG应为Xgal吧。

宿主菌一般都用什么菌？

追答

对，是打错了，正想改，你比我还快。
当然最常用的是大肠杆菌了