蓝白斑筛选问题！！

Question

蓝白斑筛选重组子时首先是氨苄筛选，其次是半乳糖苷酶活性筛选。感受态细胞中应该也有质粒，而且应该也有氨苄抗性标记，而且感受态如DH5α的半乳糖苷酶应该是失活的，那么它也不能降解X-gal，与重组子一样的啊，那么怎么保证筛选到的是重组子呢？难道感受态中没有质粒吗？如果没有制备感受态的步骤中怎么没有提到呢？晕死了！！！

Answer 1

Answer 2

在重组质粒表达的实验中，蓝白班筛选是要检测重组质粒是否表达，而氨苄的加入主要是为了防止培养过程中染菌。
对于半乳糖苷酶活性筛选，首先重组质粒所选的质粒与野生型（感受态）不同，上面有多克隆位点，蛋白标签，和多对操纵子、启动子，其中就包括乳糖操纵子。当培养液中加入IPTG，IPTG可以和乳糖操纵子下游的的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白从DNA上脱离，激活半乳糖苷酶的表达。因而重组质粒可以利用x-gal而感受态不能。这个是蓝白斑筛选的主要原理。结果中白斑表示重组质粒表达的菌体，蓝斑表示未表达。
至于氨苄筛选，通常不会利用氨苄抗性进行筛选，因为感受态中是否有氨苄抗性基因很不确定，无法得到准确的结果。追问

分子克隆中明确表示氨苄筛选在蓝白斑筛选中的共同作用，你的回答我不认可！我关心的是感受态到底有无质粒，如果有质粒那么质粒是否携带抗性标记？

追答

希望这个问题你能自己考虑一下。野生菌通常都有质粒，在制备感受态、表达外源基因的过程中，是否有去掉原质粒的必要性，我可以明确告诉你现在有技术可以人工合成没有质粒的微生物，但关键是有没有必要。
关于氨苄筛选，我手上几篇关于重组的文章中，重组体系的构建只有空白对照中没有氨苄，阴性对照也加了，而且没有关于氨苄的阳性对照组（不加入X-gal），觉得可以排除氨苄为控制变量的可能，因而也就不存在氨苄筛选。在实验结果里，空白对照组有明显染菌现象。基本上可以认为氨苄的主要作用是防止染菌。另外，对于一个重组的工程菌，有可以完全筛选的蓝白斑筛选，为什么还有加入一个只能部分（甚至部分也不能）筛选的氨苄筛选。
如果这些问题你不愿意思考，实验不做也罢。而且你这种问问题的态度吗，以后爱问谁问谁！

追问

我的意思是，氨苄确实可以抑制没有转入外源质粒的菌体的生长。氨苄一方面防止染菌，另一方面也有筛选的作用，这个不能否定。如果没有转入外源质粒的菌体可以生长的话，那么肯定干扰了重组子的筛选，因为它也是白斑。

追答

我记得我们boss有一次问我细胞培养是氨苄的作用和不足，加入氨苄后，有时无法发现细胞液染菌。而且我做实验的过程中确实有加入氨苄仍然有杂菌生长的现象，不可排除突变体的出现，而且在氨苄阳性的培养基中，氨苄抗性的突变体的出现合情合理。刚才查了下我用过的几个感受态，都是敲出内切酶和甲基化酶的修饰菌体，应该还是有质粒的，可能也会还有抗性基因。所以觉得氨苄的筛选作用较小，更多的筛选还是应该通过蓝白斑，其实这个筛选也没有什么过于明确的原则，只要找出重组子就好了。做实验过程中你也发现了，凡是涉及到培养的，都会氨苄、庆大霉素之类的抗生素存在，或者其他一些很苛刻的培养条件限制

追问

嗯，是的，加双抗培养细胞。我搜了其他论坛，上面说感受态没有质粒。应该是这样的，也没有必要就这个问题再钻了。还是采纳你吧！

本回答被提问者采纳

Answer 3

感受态细胞中应该也有质粒，而且应该也有氨苄抗性标记，这句话不对。感受态细胞中有质粒，但是没有抗性。而作为载体的外源质粒是具有抗性位点的。
产生蓝白斑是针对外源质粒导入了感受态细胞之后而言的（只有导入了外源的质粒，该感受态才具有抗性，能够在含有氨苄的培养基上生存），导入的外源质粒有两种情况，一来是自身连接的，也就是没有插入目的片段，那个时候，编码半乳糖苷酶的基因重新连接到一起，具有活性，在IPTG的诱导下可以利用X-gal产生蓝斑。因此，凡是蓝斑的就代表被导入的是空的载体。
而外源质粒被插入目的片段之后，导致编码半乳糖苷酶的基因失效，无法利用X-gal产生蓝斑，因此菌落呈无色。
纯手打，望采纳，还有不理解，请追问。谢谢~追问

我搜了其他论坛，上面说感受态没有质粒。