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酶切后纯化
质粒
酶切
的
纯化
方式会影响连接吗
答:
如果不想用胶回收方法
纯化
,可以选择吸附柱过滤除掉被切掉的小分子片段。胶回收纯化的好处是直观的判断酶切实验结果是否理想,是否酶切完全,胶回收可以避免收集不完全酶切的质粒片段(包括完整的环状质粒和线性质粒)等等。质粒,目的基因
酶切后
,酶切液琼脂糖凝胶电泳,将含目的条带的凝胶切下来,进行胶...
用于与载体连接的pcr
酶切
产物是如何
纯化
的
答:
跑胶后找到目的片段,切胶回收,
纯化
的传统法就是将PCR产物加入2倍体积的乙醇-20度沉淀过夜后低速短暂离心(如 3000rpm离心1~2min),弃掉上清,然后用70%乙醇洗涤一次后,弃掉乙醇,放干后再用无菌水或者TE溶解。当然这种方法对PCR产物纯化后回收率是很低的,你需要多做几管PCR,然后一起纯化回收。
双
酶切
时,PCR样为何需
纯化
?
答:
首先,你用的是质粒模板;其次,你扩增得到的非单一条带,如果不
纯化
直接
酶切
,那么得到的将是带有相应酶切位点的几种片段,继续试验的话,菌落PCR鉴定时可能会出现几种不同大小的条带,运气好的话也会有阳性克拢你也可以做个试验尝试下。
质粒,目的基因
酶切后
分离
纯化
再连接,是指酶切液经过一系列处理后连接还...
答:
质粒,目的基因
酶切后
,酶切液琼脂糖凝胶电泳,将含目的条带的凝胶切下来,进行胶回收,然后再在连接酶的作用下,4度和16度都可以(看你的目的基因的情况决定),将目的基因与目标质粒连接在一起.
双
酶切
时,是直接用pcr产物就可以,还是需要
答:
而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg,而PCR
纯化
后的产物(50体系)约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,
酶切
完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。
sumo融合蛋白的
纯化
时挂在Ni亲和柱上时是不是就还可以加sumo蛋白
酶酶
...
答:
不是绝对的,两种方法其实都差不多。但是柱切和洗脱后酶切还是有不同的。柱切比较方便,
酶切之后
直接收流穿的部分就是目的蛋白。缺点是在洗脱之前不知道蛋白产量,可能努力了半天什么都没有,而且有些蛋白不稳定,可能在柱切过程中沉淀在柱子上了。洗脱后再切,比较直观的检测初步富集的蛋白量,再决定...
做基因多态性,PCR产物必须
纯化
后才能
酶切
吗
答:
与其浪费内切酶和时间,何必呢,你还不如
纯化后酶切
,只不过多了个步骤而已。至于PCR产物的保存,没有什么特殊要求,反应结束后你可以直接冻在-20。也可以跑电泳后切下你的目的条带放在四度,如果是纯化了保存,如果你不反复冻融的话,放几年没有问题。DNA是很稳定的 ...
单
酶切
需要回收吗
答:
需要。回收的目的主要是
纯化
和浓缩目的片段,并去掉
酶切
体系中的所有组分及非特异性片段。从连接效率上来看,不管哪种酶切方式,能回收的尽量做回收。
分步双
酶切
答:
不用试剂盒,也不用再次
纯化
pcr产物,会损失。我可以告诉你步骤:如果两种
酶
的buffer浓度相同可以同时加进去切,如果不相同,先用低浓度切,再用高浓度切。我只说后一种:30/50ul体系中2ul第一种酶,3ul buffer,按照你pcr产物的亮度来配比,不足部分用水补充,反正达到30ul就可以了,切两个小时后...
酶切后
连不上表达载体是什么原因
答:
这个你单
酶切
最好是要过夜,而且跑电泳尽量时间长一些,如果有一条带,就说明差不多完全切开了,如果害怕不安全,可以把这条带切胶回收
纯化
,用纯化后的连接,自连的可能性会小一些
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