简述几种蛋白质含量的测定方法及原理。

Question

如题所述

Answer 1

【答案】：蛋白含量的测定常用的方法有：考马斯亮兰G-250染色法、双缩脲法、福林一酚试剂法、紫外吸收法。
(1)考马斯亮兰G-250染色法：考马斯亮兰G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在595nm处有最大的光吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。因此可比色测定，测定范围为0.01～1.0mg/ml。
(2)双缩脲法：蛋白质含有多个肽键，因此有双缩脲反应，即Cu²⁺与蛋白质的肽键络合，形成紫红色络合物，此物在540nm处有最大的光吸收，可以比色测定，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。测定范围为0.5～10mg/ml。
(3)福林-酚试剂：第一步是双缩脲反应，反应生成的络合物以及酪氨酸、色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂(即福林．酚试剂)，得到深蓝色产物，可在750nm比色测定，范围为0.03～0.3mg/ml，或用500nm比色测定，范围为0.05～0.5mg/ml。
(4)紫外吸收法：大多数蛋白质在275～280nm处有一特征的最大光吸收，这是因为蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基的苯环含有共轭双键的缘故。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值(A_280nm)与其浓度成正比，因此可作定量测定。测定范围为0.1～1.0mg/ml。
(5)凯氏定氮法：每一种蛋白质中均含有较恒定的氮(14%～16%)，利用浓硝酸将蛋白质消化分解，使其中的氮转变成铵盐，再与浓NaOH作用，使氨气放出并被吸收在酸液中，用滴定法测定多余的酸，从而可以知道蛋白质中的含氮量。因此方法操作烦琐，目前已很少应用。