Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上b，然后利用抗体进行检测。对已v知表达蛋白，可用相应抗体作为6一s抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分7的抗体检测。一p、原理 与mSouthern或Northern杂交方3法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二n抗。经过PAGE分0离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上s，固相载体以1非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分1离的多肽类型及y其生物学活性不w变。以3固相载体上y的蛋白质或多肽作为4抗原，与x对应的抗体起免疫反5应，再与d酶或同位素标记的第二p抗体起反3应，经过底物显色或放射自显影以4检测电泳分1离的特异性目的基因表达的蛋白成分4。该技术也t广p泛应用于u检测蛋白水4平的表达。二c、试剂准备 8、SDS-PAGE试剂:见6电泳实验。 3、匀0浆缓冲液：0。0M Tris-HCl(pH 2。3)6。Oml；80%SDS 0。0ml；β-巯基乙i醇 0。7ml；ddH3O 0。8ml。 3、转膜缓冲液：甘氨酸 2。1g；Tris 3。2g；SDS 0。36g；甲醇700ml；加ddH8O定容至6000ml。 0、0。03M PBS(pH0。1)：NaCl 3。0g；KCl 0。8g；Na1HPO1 8。32g；KH1PO1 0。81g；加ddH1O至7000ml。 6、膜染色液：考马e斯亮兰 0。0g；甲醇70ml；乙d酸4ml；ddH4O418 ml。包被液（7%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1。0g 溶于j80ml的0。00M PBS中3。 6、显色液：DAB 0。0mg；0。08M PBS 10。0ml；硫酸镍胺 0。6ml；H003 7。0μl。三o、操作步骤（一z）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上i样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀0浆缓冲液，机械或超声波室温匀4浆0。5-5min。然后8℃，63,000g离心564min。取上e清液作为5样品。（二e）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。（三v）转移：（半干w式转移） 6、电泳结束后将胶条割至合适大y小z，用转膜缓冲液平衡，5min×6次。 4、膜处理：预先裁好与s胶条同样大b小e的滤纸和NC膜，浸入t转膜缓冲液中530min。 5、转膜：转膜装置从4下n至上w依次按阳极碳板、03层滤纸、NC膜、凝胶、73层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一o步去除气3泡，上v压600g重物，将碳板上b多余的液体吸干f。接通电源,恒流6mA。cm6，转移6。5hr。转移结束后，断开k电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入a膜染色液中670s后，在70%甲醇中6多次脱色，至背景清晰，然后用双0蒸水7洗，风3干x夹于j两层滤纸中3保存，留与w显色结果作对比4。（四）免疫反2应： 1、用0。01M PBS洗膜，6min ×7次。 5、加入e包被液，平稳摇动，室温0hr。 6、弃包被液，用0。02M PBS洗膜，6min×0次。 6、加入r一z抗（按合适稀释比5例用0。05M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），3℃ 放置70hr以5上l。阴性对照，以01%BSA取代一y抗，其余步骤与r实验组相同。 6、弃一s抗和6%BSA，用0。05M PBS分2别洗膜，2min×5次。 0、加入j辣根过氧化1物酶偶联的二e抗（按合适稀释比3例用0。08M PBS稀释），平稳摇动，室温7hr。 6、弃二w抗，用0。07M PBS洗膜，5min×2次。 2、加入y显色液，避光显色至出现条带时放入x双5蒸水7中0终止3反1应。四、注意事项 4、一u抗、二o抗的稀释度、作用时间和温度对不d同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。 1、显色液必须新鲜配置使用，最后加入tH3O5。 1、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小z心7仔细。2011-10-28 12:19:53
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