你想知道的琼脂糖凝胶电泳

如题所述

第1个回答  2022-06-19
琼脂糖凝胶电泳
【原理】兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
【核酸分子是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液 中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离,核酸分子因而带负电荷,电泳时向正极迁移。也就是说 —— DNA上有磷酸根,在一般情况下带负电,所以必然朝正电方向前进】

一、制配胶

二、上样
1、根据你想要的量来进行跑。例如:10μl 样品,4、6μl Mark,用微量移液枪小心加入样品槽中。
【用微量移液枪小心加入样品槽中,每加完一个样品要更换枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿】

三、电泳
1、加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在110 V,电流在40 mA以上。横压跑
2、当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时(约40 min),停止电泳。
3、打开电脑和观测仪器, 紫外下拍照并观察。
注:PCR产物跑完胶结束后可放到4℃冰箱

备注:
1、凝胶厚度和孔径大小
一般而言, 较厚的凝胶 运行过程中产生热量也较多,可导致条带扩散。 由于凝胶染色的高背景或凝胶染色和/或脱色所需时长(如进行 电泳后染色 ),可能会出现可视化不佳的情况。 对于 琼脂糖 凝胶,厚度以3 - 4 mm为佳,不推荐超过5 mm厚度的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶 的厚度由制造商提供的用于凝胶灌制的垫片决定,最常见的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。
由 胶梳形状决定的 孔径大小,不仅影响样品的装载量,而且会影响条带的分辨率。 虽然较大的孔可容纳更大的样品负载,但同时也会产生粗条带,减少条带分辨率并产生污点。 而长而窄的孔可容纳的样品量虽小,但可提供更清晰的条带,以获得更好的分辨率。 减少高密度样品的进样量可提供更高强度的条带。
2、跑电泳的时间
电泳的时间短,不同长度片段的DNA条带还未分离,都聚集在一起,所以只能看见DNA含量最高的主带;而电泳时间比较长,不同长度片段的DNA条带已经分离,可以清晰看到不同长度片段的DNA条带。
3、跑出的DNA带模糊
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