通过16srDNA鉴定细菌的疑惑

Question

1、为什么不能把PCR所得溶液直接用来测序，是测序技术的限制么？提供给测序公司的应该是转化阳性的菌液，还是提取出来的质粒？
2、pcr产物跑胶后要胶回收再做载体连接，能否用pcr后溶液回收？
3、其操作流程是这样么？DNA提取---16srdna片段pcr扩增---跑胶检测---
胶回收---T载体连接---质粒转化---阳性克隆菌筛选（白色菌落）--提取质粒？--送去测序

Answer 1

1. PCR所得溶液必须经过纯化后才能进行测序。因为PCR反应中的残留物很多，都会影响测序的结果，可以说是测序技术的限制。目前PCR完后用酒精醋酸钠进行纯化，再上机检测。菌液和质粒都可以进行测序。
2.PCR产物跑胶的目的是找到目的条带，因为在你PCR的过程中也许会产生一些非特异性的扩增，这些是不能拿去做转化的。所以跑玩PCR后要跑胶，找到目的片段再进行切胶回收。溶液回收是不行的。
3.基本流程就是这样的。DNA提取完了以后还是要跑胶检测的，测定DNA提取的效果和浓度。胶回收一定是找到目的片段的胶才能切胶回收，非目的片段的是没有用的。扩增不需要用高保真酶，TAQ酶会在产物末端直接加上A碱基，能直接和T载体连接，方便的很。

Answer 2

1 直接PCR溶液中含有酶、缓冲体系会干扰测序的进行，因此不能直接测序。现在提供给测序公司的可以是菌液也可以是质粒，二者价格略有不同。

2 基本不行。因为可能会有少量非特异性条带存在。但是如果你采用的是高特异性PCR，则产物可直接进行连接。

3 实际上，你扩增应该用高保真酶，如Pfu、KOD等。扩增结束后用Taq加上A末端。然后割胶回收，连接载体。

Answer 3

1.质粒
2.否
3.是