拟南芥激活标签实验

Question

实验方法

Answer 1

一、 拟南芥的种植拟南芥种子均匀播种于育苗介质中（播种前最好将种子晒一天），浇透水，用保鲜膜封好以保持湿度，自然温度（室内但非温室）条件下萌发，待种子萌发且幼苗长出两片子叶后，去掉保鲜膜，以防止幼苗徒长，注意顶起浇灌营养液，以保持一定的温度和湿度，并注意喷农药以防止各种病虫害的发生。待长到易于移栽的大小时，将其移入盛满培养土的边长大约12厘米的方形培养杯中，每杯载四棵。二、 菌种培养1：用-80℃冰箱中保存的含有激活标记载体pSKI015的农杆菌菌种重新划平板进行活化，28℃恒温倒置培养两天后挑取多个单克隆，分别于约5ml液体LB液体培养基+kan50mg/L+Amp50mg/L培养基中扩大培养，28℃，220rpm震荡培养至菌液OD600为0.5左右（约培养一天）。2：将各培养菌的试管编号，然后放入超净工作台内;3:再取约1.5ml的无菌Ep管于超净工作台内编号，然后分别加入300μl无菌甘油，再从对应号码的试管中用移液枪分别移入400μl菌液，然后盖好，放入-80℃冰箱中保存菌种。三、 激活标记载体四个串联增强子的PCR检测带有激活标记载体的农杆菌在4℃保存或是继代培养时，载体上的四个串联增强子容易逐个丢失。在4℃保存一到两个星期，一般丢失一个拷贝；保存一个月后，可能就仅剩一个拷贝。另外，农杆菌的继代培养可能会影响增强子的稳定性，于是对其进行了检测分析。结果发现，随着摇菌次数的增多，增强子含有几率在下降，经过四次摇菌后增强子基因丢失超过50%，因此，菌种在使用前需用PCR的方法检测增强子是否完整。如果串联增强子完整，PCR产物电泳结果应包括一条长度为1.46Kb的相对很亮的特意条带。四、 转化用农杆菌菌液的制备取-80℃冰箱中保存的PCR检测含有完整四个增强子的农杆菌GV3101约100μl于50ml液体LB培养基中扩大培养（加入氨苄青霉素和卡那霉素），20℃，220rpm震荡培养（大约培养一天）至菌液OD600为1.0左右，倒入大离心管中，5，000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用50%蔗糖重悬，最终菌液OD600在0.8-1.0左右，在农杆菌菌液中加入Silwetl-77（0.2μl/ml），即可用于转化。五、 根癌农杆菌介导的花侵染法转化拟南芥待拟南芥植株长出顶生花序后，开始通过根癌农杆菌介导的花侵染法将激活标记载体pSK1015导入拟南芥基因组即进行转化，并将转化前结的果荚和已经完全开放的花剪掉，以保证尽可能多的尚未完全开放的花蕾用于农杆菌的转化，以获得尽可能高的转化效率。一般在傍晚或晚上用滴管将准备好的菌液滴在拟南芥花序上，或者将花序在菌液中侵润，将植株放在塑料盆中，用塑料薄膜覆盖以保持湿度，暗培养过夜后，掀开塑料膜将拟南芥置于阳光下，并喷雾。每五到七天侵染一次，其间要注意农杆菌对植株的影响（是否引起大量的花败育），来调整菌液浓度及侵染次数（若农杆菌液对植株的影响较小，就应当适当增加菌液浓度及侵染次数，反之应当减少）。六、 Basta抗性苗的筛选待农杆菌转化的盐芥种子成熟后，将种子全被收集到玻璃瓶中，开口晾干，除去果荚皮等杂质，即可进行抗性秒的筛选。将收获的转基因拟南芥T1代种子再种植于育苗介质中，使其萌发，为了尽量使种子萌发一致，可以将种子播种于育苗介质后，喷足水，或者将种子泡在水中一定时间，再播种于育苗介质中。带幼苗长出两片针叶后，用0.2%的Basta溶液喷洒，没有黄化的绿苗即为Basta抗性苗，从拟南芥Basta抗性秒提取DNA并惊醒PCR检测，然后进行反向PCR法扩增得到侧翼序列，这样才能分析得知所激活的基因的序列及功能，才能建立起激活标记突变体库