PCR技术的主要步骤如下：
1、dna变性：（90℃-96℃）：在热作用下，双链dna模板的氢键断裂，行程单链dna。
2、退火：（60℃-65℃）：体系温度降低，引物与dna模板结合形成局部双链。
3、延伸：（70℃-75℃：以dntp为原料，在taq酶的作用下（72℃左右），以dntp为底物，从引物的3′端开始，从5′→3′端延伸，用模板法合成互补dna链。
每一个周期都被变性、退火和延长，使dna含量加倍。现在有些pcr即使taq酶活性不是最好的，也能在很短的时间内复制，因为扩增区域很短。
因此，可改为两步法，即在60℃-65℃同时进行退火和延伸，以减少一次升温和降温过程，提高反应速度。
底漆设计基本原则
1、引物长度：15-30bp，一般约20bp。
2、引物碱基：g+c含量为40-60%，g+c太少扩增效果不好，g+c太多易出现非特异性条带。ATGC应随机分配，以避免超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸。
3、引物中不应有互补序列。
4、两个引物之间不应有互补序列，特别是要避免3′端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的同源性不应超过70%。引物3′端的8个碱基不能在待扩增区域外有完整的互补序列，否则容易导致非特异性扩增。
6、底漆3'端的底座，特别是最后两个底座，应严格匹配。最好的选择是G和C。
7、底漆的5'端可以改性。例如，添加限制性酶位点，引入突变位点，用生物素标记，荧光物质，地高辛，添加其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
扩展资料：
pcr技术的基本原理类似于dna的自然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
pcr是一种体外dna扩增技术，它依赖于dna聚合酶在模板dna、引物和四种脱氧核苷酸存在下的酶促反应。待扩增的DNA片段及其两侧互补的寡核苷酸链引物通过“高温变性-低温退火-引物延伸”三步反复循环，使DNA片段的数量成倍增加，因此在短时间内，我们需要大量的特异性基因片段。
在环境检测中，靶核酸序列经常存在于细胞提取物等复杂混合物中，且含量非常低。对于检测这种复杂群体中的特定微生物或基因，杂交是不敏感的。
pcr技术可以将目标序列扩增几个数量级，然后用探针杂交检测扩增序列，用于微生物种群结构的定性或定量分析。pcr技术常与rt-pcr、竞争pcr、巢式pcr、rapd、ardra等技术结合使用。
第一代pcr是一种常用的定性pcr技术。采用普通pcr扩增靶基因，琼脂糖凝胶电泳分析产物。第二代pcr为实时pcr（qpcr）。它可以通过在反应体系中加入荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，并用荧光曲线的cq值来量化初始目标基因的浓度。
第三代pcr技术，数字pcr（dpcr，digpcr）是一种新的核酸检测和定量方法。它可以通过直接计数目标分子而不依赖于任何校准品或外标物来确定被检测到的目标分子的绝对数量，低至单拷贝。
PCR芯片技术是PCR仪器小型化的发展趋势之一，PCR芯片就是在这一趋势下诞生的。PCR芯片是一种微型PCR仪器，用于在微载体上进行PCR反应。芯片pcr不仅节省了大量试剂，降低了实验成本，而且有助于改进。
参考资料：