人民共和国经过经济恢复时期，各条战线形势大好。到了1954年，烈性传染病已被控制，防疫的重点转向常见的、多发的传染病。汤飞凡呈请卫生部批准他摆脱行政事务，恢复他中断了20年的研究工作。获准后，他首先恢复了对沙眼的研究。那时沙眼在世界上许多地区广泛流行，中国人口中有50%患有沙眼，边远农村有“十眼九沙”之说，危害极大。
沙眼流行至少已有三四千年，自微生物学发轫之始已受到重视。1887年，微生物学创始人之一科赫曾从沙眼病灶中分离出一种细菌——科－魏氏杆菌，认为是沙眼的致病菌，最早提出了沙眼的“细菌病原说”，但很快被否定了。1907年哈伯斯忒特和普罗瓦采克在沙眼病灶中发现包涵体，认为可能是病毒，但未定论。20年代中，尼古拉证明沙眼材料用砂棒滤掉细菌仍有感染性，首先提出了沙眼的“病毒病原说”，但未能证实。1928年野口英世从沙眼材料里分离出一种细菌——“颗粒杆菌”，认为是病原菌，重新提出了“细菌病原说”，此说曾引起广泛注意。1930年，汤飞凡和周诚浒曾重复野口的试验，却得到阴性结果。1933年，汤飞凡用美国保存的野口“颗粒杆菌”种进包括他自己在内的12名志愿者的眼睛里，证明它不致病，又推翻了“细菌病原说”，“病毒病原说”重新占了上风。直到1954年虽然经过许多实验室的努力，因病毒未被分离出来，仍然不能定论。汤飞凡早在30年代研究病毒性状和包涵体本质时已逐渐形成一种想法，即微生物在自然界是从小到大的一个长长的系列，在已知的病毒和细菌之间存在着“过渡的微生物”，如立克次体、牛胸膜肺炎支原体等。他认为沙眼病原体是比牛痘病毒更大的、接近立克次体的“大病毒”，许多性质近乎鹦鹉热和鼠蹊淋巴肉芽肿病毒。循着这条思路，他制定了研究计划，同步进行了沙眼包涵体研究、猴体感染试验和病毒分离试验。为了保证病理材料可靠，他特别请北京同仁医院眼科专家张晓楼鉴定所选的典型病例，从1954年6月开始了工作。
在这一年的时间里，汤飞凡亲自带助手从同仁医院沙眼门诊取回材料201份，在48例中找到包涵体，并发现包涵体有四种形态：散在型、帽型、桑椹型和填塞型，阐明了它们的形成和演变过程，澄清了自从1907年发现沙眼包涵体以来的混乱认识。他在论文里写道：“原体和始体均为沙眼病毒的演变形式……。原体代表静止，始体代表活动繁殖状态。原体变始体，始体又产生原体。……我们可推论沙眼病毒的原体侵入或被吞噬至上皮细胞内，即增大其体积变为始体，繁殖发展成散在型包涵体，以后继续发展成帽型或桑椹型，终至填塞型的包涵体。此时或在此以前，始体复变为原体，最后细胞被原体填塞以致破裂，原体涌出，再侵袭别的健康细胞，重复感染。”他实际上描述了沙眼病原体侵入宿主细胞后的发育周期，在沙眼衣原体分离成功后，已在人工感染和动物模型中被完全证实。现已知道沙眼衣原体的一个发育周期约为48小时。
这一年，汤飞凡所进行的猴体感染试验也获成功。他和助手使猴子造成沙眼，从中发现：猴子与人的眼结膜解剖学构造不同，患了沙眼后症状也不同：没有瘢痕和血管翳。他们还在猴子的沙眼病灶中找到了从来没有人发现过的猴沙眼包涵体。
但是，这一年他们所进行的分离病毒的努力失败了。1951和1953年日本学者荒川和北村报告用幼鼠脑内接种或鸡胚绒毛尿囊膜接种法分离病毒成功，不过因为没有能够拿到病毒而未得到承认。汤飞凡认为用他们的方法分离出沙眼病毒是可能的。因为他相信沙眼与鹦鹉热和鼠蹊淋巴肉芽肿病毒性质相近，而后二者能在鼠脑内生长。于是他决定病毒分离试验先从重复荒川、北村的实验入手。但是一年中他和助手从201例典型Ⅱ期沙眼患者中取样，接种了2500余只幼鼠，没有一只发生类似荒川、北村所描写的症状，没分离出一株病毒。试验失败了，汤飞凡虽没有完全否定用幼鼠分离沙眼病毒的可能性，但决定把它搁置起来，改用鸡胚来分离。
1955年7月，重新开始分离病毒试验，这次他没有采用荒川的绒毛尿囊膜接种，而采用了研究立克次体常用的卵黄囊接种。他分析了影响病毒分离的因素，认为除了选择敏感动物和适宜的感染途径外，还需抑制杂菌生长，决定在标本中加抗生素作为抑制剂，因为当时临床上已经知道链霉素治疗沙眼无效而青霉素有无疗效还不明了，所以选了这两种抗生素，没想到竟然那么顺利，只作了8次试验就分离出了一株病毒。
这个世界上第一株沙眼病毒被汤飞凡命名为TE8，T表示沙眼，E表示鸡卵，8是第8次试验，后来许多国家的实验室把它称为“汤氏病毒”。虽然分离出了病毒但成功率太低，后来知道是因为青霉素能杀死病毒。他们改进了方法：取消了青霉素，加大了链霉素的量，延长了链霉素在标本中的作用时间，大大提高了成功率。用改进的方法，病毒分离率达到50%，不到两个半月内又连续分离出病毒8株。试验成功了，有人建议汤飞凡赶快发表成果，因为世界上许多实验室在竞相分离沙眼病毒，不赶快发表，怕被人抢先。但作风严谨的汤飞凡没有同意，他认为还没有达到科赫定律的要求。科赫定律要求确定一种微生物是某种传染病的病原体，第一要能从相应的病例里分离出这种微生物；第二要能在宿主体外培养出这种微生物的纯培养；第三分离出来的微生物要能在另一健康宿主中引起典型的病变和症状；第四还要能把这种微生物从这个宿主中再分离出来。汤飞凡又做了很多工作，证明了TE8能在鸡胚中继续传代，用它感染猴子能造成典型的沙眼并能找到包涵体，能把它从猴子眼里再分离出来，得到“纯培养”。他还用分级滤膜证明TE8是可过滤的并测出它的大小在120—200纳米之间。然后，他才于1956年10月发表了论文。最后，他又在1957年除夕将TE8种进自己的一只眼睛，造成了典型的沙眼，并且为了观察全部病程，坚持了40多天才接受治疗，无可置疑地证明了TE8对人类的致病性。
沙眼病毒分离成功在国际科学界引起了巨大的反响，因为这是一个关键性的突破，将长期处于低潮的沙眼研究一下子推上了高潮。英国李斯特研究所的科利尔1957年得到TE8和TE5后很快证实了汤飞凡等的工作。1958年他又用汤飞凡的方法在西非冈比亚分离出沙眼病毒。不久，美国、沙特阿拉伯、以色列等国家与地区的医学家也相继分离出沙眼病毒。1958年，琼斯在美国从一个患性病的妇女子宫颈中分离出沙眼病毒，解决了这种仅在美国每年就有上万人受害的性病病原问题。有了病原体便可进行系统的、深入的研究，从而确定了沙眼和鹦鹉热及鼠蹊淋巴肉芽肿的病原体同属于介于细菌与病毒之间的一组微生物。这导致了微生物分类的重大变革，增加了一个衣原体目，沙眼病毒正式改名为沙眼衣原体。有了病原体可供试验，证明许多简单的方法，如干燥、日晒、热水烫、以及许多常用的消毒药都能有效地消毒，同时还筛选出许多特效药。沙眼的治疗和预防在短短几年里取得了前所未有的进展。
