巴斯德毕赤酵母表达系统采用一种整合型载体作为主要工具，常见的载体如pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815和pPSC3K，它们的特点是包含醇氧化酶-1（AOX1）基因的启动子和终止子，通过多克隆位点（MCS）分隔，为外源基因提供了插入位置。载体还带有组氨醇脱氢酶基因（HIS4）的选择标记，以及3'AOX1区，使得外源基因在5'AOX1启动子的调控下表达。构建过程类似于酿酒酵母基因工程，主要方法包括经典遗传学操作（如突变体分离等）和分子遗传学手段（如DNA转化）。
为了获得高表达稳定性，外源基因通过同源重组整合到宿主酵母的染色体基因组上，形成整合型表达载体，与质粒型载体相比，整合型载体的拷贝数变化较大，多拷贝表达菌株能产生更多蛋白。获取高产量的方法有两种：一是通过筛选大量转化子自然获得，二是通过多次拷贝插入和交换整合到染色体。尽管摇瓶培养便于筛选，但由于无法精确模拟罐发酵条件，可能影响蛋白表达，因此需要在摇瓶培养中优化条件，如控制pH值，保证通气和碳源供应，以提高表达效果。
不同的转化子在相同载体下，表达水平可能差异明显，因此筛选高产菌株至关重要。在培养条件上，需要设定适宜的缓冲系统和pH值，维持最大通气，适量添加氨基酸来源以促进蛋白合成。在诱导阶段，通过切换至甘油和甲醇的交替使用，可以达到最佳的蛋白表达效果。
巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。