巴斯德毕赤酵母表达系统采用一种整合型载体作为主要工具,常见的载体如pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815和pPSC3K,它们的特点是包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和终止子,通过多克隆位点(MCS)分隔,为外源基因提供了插入位置。载体还带有组氨醇脱氢酶基因(HIS4)的选择标记,以及3'AOX1区,使得外源基因在5'AOX1启动子的调控下表达。构建过程类似于酿酒酵母基因工程,主要方法包括经典遗传学操作(如突变体分离等)和分子遗传学手段(如DNA转化)。
为了获得高表达稳定性,外源基因通过同源重组整合到宿主酵母的染色体基因组上,形成整合型表达载体,与质粒型载体相比,整合型载体的拷贝数变化较大,多拷贝表达菌株能产生更多蛋白。获取高产量的方法有两种:一是通过筛选大量转化子自然获得,二是通过多次拷贝插入和交换整合到染色体。尽管摇瓶培养便于筛选,但由于无法精确模拟罐发酵条件,可能影响蛋白表达,因此需要在摇瓶培养中优化条件,如控制pH值,保证通气和碳源供应,以提高表达效果。
不同的转化子在相同载体下,表达水平可能差异明显,因此筛选高产菌株至关重要。在培养条件上,需要设定适宜的缓冲系统和pH值,维持最大通气,适量添加氨基酸来源以促进蛋白合成。在诱导阶段,通过切换至甘油和甲醇的交替使用,可以达到最佳的蛋白表达效果。
巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系,是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。