改良的双缩脲法快速测定蛋白质含量
(一) 方法原理
蛋白质有两个以上的肽键, 因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu++ 形成紫红色络合物, 其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比, 而与蛋白质的分子量及基酸成分无关。显色反应受温度影响颇大, 在常温(20～25℃)下需1小时, 40℃需15分钟, 60℃需5分钟。
(二) 仪器、设备
1. 仪器 光电比色计；离心机(4000转/分)；分析天平(感量0.0001克或0.001克)；恒温振荡器或恒温水浴锅；离心管、刻度吸管。
2. 试剂 4%硫酸铜(CuSO4 ·5H2 O)溶液；2.5%酒石酸钾钠溶液；双缩脲试剂配制: 在500毫升容量瓶中, 依次加入4%CuSO4 ·5H2 O 30毫升和2.5%酒石酸钾钠100毫升, 再慢慢加入5mol/L KOH 30毫升, 最后用蒸馏水稀释至刻度。使用时,再将上述溶液与透明度良好的异丙醇混合。
(三) 测定步骤
1. 酪蛋白标准曲线制备: 称取国产酪蛋白质2克(磨细至80目)于0.15mol/L KOH溶液中, 加热溶解并定容至100毫升, 分别取此溶液0.2～0.9毫升8份, 加入10毫升双缩脲试剂, 在60℃的恒温水浴振荡器中振荡5分钟显色完全, 随后以4000转/分离心10分钟,取离心液在波长550nm下, 以1cm比色杯进行比色测定, 空白为不加酪蛋白的试剂。同时取此溶液5毫升(双样)进行凯氏定氮, 乘以换算系数6.41即为酪蛋白含量。根据测得的光密度值与相应酪蛋白含量进行回归, 算出回归方程式Y=a+bX(X为酪蛋白光密度,Y为相应酪蛋白含量克)。
2. 样品处理与测定: 样品粉碎磨细通过40目筛孔, 以风干重样品或烘干重样品测定蛋白质含量。在分析天平上准确称取待测样品0.1000克, 放入干燥的25毫升凯氏消化瓶或大试管中, 内放几粒玻璃珠, 加入10毫升双缩脲试剂, 在60℃的恒温水浴振荡器上振荡5分钟, 随后以4000转/分离心10分钟, 取离心液在波长550nm下,以1cm比色杯进行比色测定, 空白为不加样品的试剂溶液。
(四) 结果计算
将样品测得的光密度值代入酪蛋白回归方程Y=a+bX(其中X表示样品光密度值,Y代表样品蛋白质含量克)。再乘以释倍数1000,即为100克样品中蛋白质含量(克)。
附注:
(1) 对含脂肪高的样品溶液与双缩脲试剂混合后, 若有雾状沉淀,需让其静置二小时以上, 再离心, 取其清液比色。
(2) 异丙醇可降低淀粉的溶解性,有利于蛋白质提取及显色。
http://biology.guangztr.edu.cn/jiaoxue/doc/gaoer/2.htm