基因工程

Question

1.内含子既然可以转录也就是有相应mRNA合成，为什么不能翻译？
2.获取目的基因时“真核细胞基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达”这一句话为什么？
3.获取目的基因人工合成的方法之一逆转录法，书上是这么写的：“以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后再在酶的作用下合成双链DNA”。这里是讨论目的基因的获取，而上面所写已经存在目的基因了，是从哪来的？
前两个问题我已经知道了，现在主要是第三个问题...
披着狼皮的羊人：请问若目的基因在基因文库中获取，为什么还要以目的基因转录成的信使RNA逆转录？直接合成不就行了？
tinysj ：这里的目的基因似乎不是推测的，人工合成主要有两种途径，这里是指除推测的另一种途径...

Answer 1

不好意思，搞错了
一,逆转录法
逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA,再反转录成cDNA,然后进行cDNA的克隆表达.
1,mRNA的纯化
mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.
方法:亲和层析法
2,cDNA第一链的合成
一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.
用放射性探针法检测.
3,cDNA第二链的合成
以cDNA第一链为模板合成第二链.
4,cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类:质粒DNA和噬菌体.又将其分为表达型载体和非表达型载体.选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法,有利于目的基因的筛选.
cDNA片段与载体的连接通常采用下面方法:
加同聚尾连接:在载体和cDNA的3'末端加上互补的同型多聚酶序列.
人工接头连接:所谓人工接头是指用人工合成的,连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片断.
5,将重组体导入宿主细胞
6, cDNA文库的鉴定
7,目的cDNA克隆的分离和鉴定
(1)核酸探针杂交法
(2)免疫反应鉴定法
逆转录-聚合酶反应法.该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链,不需再合成第二链,而是在特异引物的协助下,用PCR法进行扩增,特异地合成目的cDNA链,用于重组,克隆.

Answer 2

1 又称沉默DNA,真核基因中的非翻译区，它不被表达于蛋白质分子或成熟的mRNA中 

2 DNA要经转录，翻译才能表达 

3 目的基因在一般在基因文库获取,还从cDNA文库中获取和从含目的基因生物细胞中获取

这些问题都是围绕中心法则来解，在高中课本有详解

参考资料：http://baike.baidu.com/view/15948.htm http://biotech.nstm.gov.tw/03/032.asp

Answer 3

基因工程是什么