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酵母蔗糖酶的分离纯化和活力测定
实验简介：酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究种具有重要意义。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母作为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶。并对其活力进行测定。
实验原理
蔗糖酶主要存在于酵母中，但工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可得到较高纯度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5min,每产生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
实验操作
1. 提取
(1) 准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
(2) 将10g湿啤酒酵母，和适量（5g）二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。
(3) 缓慢加入预冷的30mL去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相，至酵母细胞大部分研碎，以便将蔗糖酶充分转入水相中。
(4) （可选项） 研磨时用显微镜检查研磨的效果。
(5) 将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机，4℃，10000rpm，离心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心15min。
(7) 将清液转入量筒，量出体积，用广泛pH试纸检查上清液pH，用1mol / L 醋酸将pH调至5.0，称为“粗级分Ⅰ”。留出1.5mL测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁的离心管中。
2. 热处理和乙醇沉淀
(1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，45℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
(2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
(3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。
3. DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白
(1) 离子交换剂的处理
称取1.5克DEAE纤维素(DE-32)干粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(约50m1)，轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时(不超过1小时)，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，搅匀，浸泡0.5小时，用去离子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用(因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收)。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过并回收的，按“碱一酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液处理，然后水洗至中性。
(2) 装柱与平衡
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的pH与缓冲液相同或接近时即可上样。
(3) 上样与洗脱
上样前先准备好梯度混合器，详见附录TH-500梯度混合器使用说明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅱ(注意玻璃搅棒头必须烧圆，搅拌溶解时不可将离心管划伤)，若溶液混浊，则4 000r／min离心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇级分Ⅱ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量)，将剩余的3.5mL上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，上样后用约30mL缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，注意从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然后打开梯度混合器，采用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30mL含0.2mol／L浓度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.缓冲液，进行线性梯度洗脱，连续收集洗脱液，控制流速2.5～3.0mL／10min。测定每管洗脱液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脱液酶活力的定性测定
在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸缓冲液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脱液，反应5min，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2～3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒人10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管，此即“柱级分Ⅲ”。
4. 各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸缓冲液(也可以用pH5～6的去离子水代替)稀释各级分酶液，测出酶活合适的稀释倍数：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀释倍数仅供参考。
按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热 8-10min，以5min生成的还原糖的毫克数为纵坐标，以试管中lmL反应混合物中的酶浓度(mg蛋白／m1)为横坐标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。
表1 各级分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性测定
各管名称 对照 级分Ⅰ 级分Ⅱ 级分Ⅲ 葡萄糖
管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸缓冲液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即摇匀开始记时，室温准确反应5min后，立即加1mL 0.1M NaOH中止反应
二硝基水杨酸溶液 mL 1.0
用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热5min，立即用水冷却3分钟。
H2O/mL 4.0
A520
稀释后酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考马斯亮兰法测定各级分蛋白质含量
(1) 蛋白质标准曲线制作
取14支试管，分两组按下表平行操作。
表2 蛋白质标准曲线制作
试管编号/mL 0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl缓冲液/mL
考马斯亮兰试剂/mL
摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
(2) 各级分蛋白质含量测定
考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10~100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
6. 计算各级分的比活力、纯化倍数及回收率
为了测定和计算下面表3中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。
1活力单位(U)＝酶在室温，pH＝4.6条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力单位/mg蛋白。
表3 各级分的比活力、纯化倍数及回收率
级
分 记录
体积
(m1) 校正
体积
(m1) 蛋白质
(mg／m1) 总蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 总活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 纯化
倍数 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
下面表4是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果：
表4 实验记录表
级分 记录体积 (m1) 校正体积计算 取样体积
(m1) 校正后体积
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 结果
在同一张图上画出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。得出各级分的活力，比活力，提纯倍数以及回收率。
六、 注意事项
从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。
七、 作业
1．为什么酶的提取需要低温操作？
2．热处理的根据是什么？
去除热敏感蛋白。
参考文献
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化学与分子生物学实验指导．武汉：武汉大学出版社，2003
2．张龙翔．高级生物化学实验选编．北京：高等教育出版社，1989
3．许培雅，邱乐泉．离子交换柱层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究．实验室研究与探索，2002，21(3):82~84
编著者——陈彦，李绍飞
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