光电鼠标与传统的机械式鼠标在定位方式上存在显著差异。其工作原理基于光电原理：鼠标内部有一个发光二极管，它会持续发射光线照亮鼠标底部，反射回来的光线经过光学透镜聚焦，进入光感应器件（微成像器）中，形成连续的图像序列。这些图像被鼠标内部的专用图像分析芯片（DSP）处理，通过分析图像上特征点位置的变化，判断鼠标的移动方向和距离，从而实现光标的精确定位。
第二代光电鼠标，如飞狐鼠标，采用了更为先进的数字光电技术。它利用红外线照射鼠标表面，每几毫秒就捕捉一次快照，并通过对比前后图像的特征来确定鼠标的坐标移动。飞狐鼠标的一大亮点是其独特的“微型光学定位系统”，每秒可发射1500次感光信号，这使得其分辨率高达800DPI，使得光标定位极其精准，能够有效避免指针抖动和不规则移动。这样的性能在高要求的操作环境中，如游戏CS中，可以确保用户操作的流畅性和准确性。
光学传感器是关键组件，它以1500次/秒的高频扫描鼠标放置的表面，通过对比图像，以确保鼠标的定位准确。然而，如果鼠标移动速度超过14～18英寸/秒的追踪范围，可能会导致光标定位失准，特别是对于移动速度可高达30英寸/秒的快速操作，如在FPS游戏中，这可能导致鼠标控制的不稳定。
光学鼠标通过底部的LED灯，灯光以约 30度角射向桌面，照射出粗糙的表面所产生的阴影，然后再通过平面的折射透过另外一块透镜反馈到传感器上。 当鼠标移动的时候，成像传感器录得连续的图案，然后通过“数字信号处理器”(DSP)对每张图片的前后对比分析处理，以判断鼠标移动的方向以及位移，从而得出鼠标在屏幕上的坐标值，再通过SPI传给鼠标的微型控制单元(Micro Controller Unit)。鼠标的处理器对这些数值处理之后，传给电脑主机。