过氧化氢(化学式:H2O2),纯过氧化氢是淡蓝色的黏稠液体,可任意比例与水混溶,是一种强氧化剂,水溶液俗称
双氧水,为无色透明液体。其水溶液适用于医用伤口消毒及环境消毒和食品消毒。在一般情况下会缓慢分解成水和氧气,但分解速度极其慢,加快其反应速度的办法是加入催化剂——
二氧化锰等或用短波射线照射。
具体步骤如下:
1. 取1g植物叶片,加5 ml 0.1 mol/L pH 7.8的
磷酸二氢钾缓冲液,研磨并静置3小时。
2. 取以上样品加入EP管,然后在4
摄氏度,10000rpm离心10min。
3. 取上清液,加入等体积的40%
蔗糖,并加入0.025%的溴酚蓝,混合均匀。
4. 用PAGE(非变性PAGE),浓缩胶:4% pH6.7,分离胶:10% pH8.9,电压150-200V电泳3-4小时。
5. 用过氧化氢酶同工酶染色液进行染色。
配方如下:
A液: 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸缓冲液 5ml,0.1 mol/L
硫代硫酸钠 3.5 ml, 3% 过氧化氢25 ml。
B液:0.09 mol/L KI 25 mL,蒸馏水25 ml。
先用A液浸泡 15分钟后,水洗,再用B液浸泡。
过氧化氢同工酶染色经典法的原理———电泳凝胶上的过氧化氢酶将H2 O2 分解生成H2 O和O2 ,但在无过氧化氢酶的区域 ,H2 O2 将K3Fe(CN) 6 还原为K4Fe(CN) 6,而FeCl3再与K4Fe(CN) 6 反应生成蓝色的
普鲁士蓝。这样 ,在凝胶的蓝色背景上所看见的透明区带即为含有过氧化氢酶的区域。