感受态细胞为何放置于负八十冰箱保存？

Question

如题所述

Answer 1

感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。 主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

主要原理
通过处理使细胞的通透性变大

性质
活细胞

制作方法
CaCl2法
1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞

细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

Answer 2

感受态细胞可不可以用液氮保存
如果没有-80冰箱,感受态细胞可不可以保存在液氮里?
有朋友说“ 大部分都不存放在液氮中，主要是其达不到要求的低温环境。多方在-80度冰箱中保存。”
我的回答：
液氮温度低于-196℃，我放在里面都怕冻坏了感受态细胞，怎么能达不到-80呢？
我的主要问题在于：会不会把感受态细胞冻坏，另外，能存放多长时间，总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提

取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟；

3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP

管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4.取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙

醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g

（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：

TaKaRa Taq TM或TaKaRa E X Taq TM的配方

分子生物学实验室常用实验方法

Answer 3

感受态细胞制备完成速冻后一般是负80度或者液氮中冻存
如果不具备条件，负20度短时间保存也可以。但是长时间保存的话需要负80度或者液氮中保存，并在培养液中加10%的DMSO
所以感受态细胞制备完成速冻后暂时存放负20度是可以的，但是不能长期保存

感受态细胞收到过点击或者氯化钙氯化铯等的处理，细胞壁以及细胞膜都有损伤，可以说是十分脆弱的细胞，如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。所以要放于-80摄氏度。

－70℃保存时.........感受态保持时间长，即使存放两个月仍能保持相当高的转化率。－20℃保存时也能在三周内保持较高转化率。

Answer 4

细胞冻存液中的二甲基亚砜（DMSO）对细胞有毒性，但深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。

并且，低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，DMSO能够稳定细胞膜，快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程, 同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，防止快速低温形成的冰晶对细胞的损伤。

但是，4℃过夜，冻存液中的DMSO对细胞可能会造成一定程度的影响，细胞活力下降。不过仅仅是一夜影响也不会很大，可以尝试复苏，不过复苏的时候会死比较多。

如果细胞不那么珍贵，或者还有其他冻存的细胞，建议放弃这批冻存的细胞，比较重要的实验也不建议用这细胞做了。

Answer 5

酵母，如酿酒酵母、裂殖酵母和毕赤酵母，通常用于生物学实验研究。酵母是易于培养的单细胞真核生物，他们的基因和蛋白质与哺乳动物具有很好的相似性，所以是优秀的生物模型。

酵母细胞用于研究基因功能，蛋白质相互作用，细胞通路等，也是大规模异源蛋白表达和小分子生产的卓越宿主，在发酵，酿造和制药行业等起着中流砥柱的作用。涉及酵母的常见的实验有酵母双/三杂交系统，突变体筛选库和同源重组，等等。

一、为什么我们需要酵母感受态细胞?

通常，在实验过程中需外源DNA引入到酵母细胞。引入基因片段（线性ssDNA或质粒）是通过酵母细胞的转化来实现的，具体方法有化学法，如醋酸锂和聚乙二醇(PEG)或电穿孔法。有效的酵母转化需要高质量的酵母感受态细胞为开始。胜任力则是指细胞能吸收游离的细胞外的遗传物质(如质粒DNA)的能力。

二、酵母感受态细胞的制备

获得感受态细胞相当简单，但许多研究人员在实现良好的生存比例和转换效率时 遇到问题。常见的误区包括由于制备条件恶劣导致高的细胞死亡率，或由于无效的感受态细胞制备导致转化效率低。

虽然酵母细胞和大肠杆菌一样容易生长和转化，但它们需要不同的处理方法来制备感受态细胞和转化。酵母细胞像哺乳动物细胞一样，有类似的处理程序。典型的酵母感受态细胞制备协议如下:

过夜培养你想转化的酵母菌菌株，使用营养丰富的培养基培养不含质粒的细胞。对于已经含有质粒的细胞，使用适当的选择性培养基来维持质粒。

当细胞密度达到1 - 2 x 107cells/mL，离心收获细胞。细胞密度可以通过使用分光光度计在OD600检测，或者使用血球计在显微镜下计数细胞。

冲洗细胞，重悬于无菌水，离心，弃上清，重复此步骤两次以彻底清洗细胞。

最后一次洗完，将细胞重悬于感受态细胞溶液，分装，大约每管108个细胞，每个转化反应将使用这些数量的细胞。分装好的管子放于-80°C，供以后实验使用。

在所有步骤中,使用质量好的无菌过滤器消毒过的试剂,以防止污染问题。

感受态细胞溶液包含最佳浓度的冷冻保护剂，这些浓度应该在你的实验室标准化，根据使用的酵母菌株和细胞的浓度。标准协议使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,这种配方被广泛应用来制备感受它细胞，也可根据具体情况进行轻微的改变或调整。