单细胞小白课堂 | 10x Genomics单细胞转录组测序入门指南

Question

如题所述

Answer 1

单细胞转录组测序作为高分文章的利器，已广泛应用于多个研究领域。本文将介绍单细胞转录组测序的基本流程以及送样要求，以帮助读者快速入门。
在送样要求方面，样本类型广泛，包括肿瘤、干细胞、胚胎、神经系统等，理论上适用于所有真核生物。样本质量在很大程度上决定了实验结果，因此需要满足以下条件：细胞直径小于40um，活率大于80%，总数大于3万，成团比例小于10%，无杂质，红细胞比例小于30%，细胞悬液浓度为700~1200个细胞/ul，体积不少于50ul。对于细胞悬液，需使用不含钙镁离子和EDTA的Buffer，并可添加BSA和FBS保护细胞活性。常用的Buffer有PBS+0.1%BSA或DMEM+10%FBS。
对于组织样本，需要进行清洗、修理、剪切，并保存在组织保存液中。组织需在48小时内解离，以确保实验的准确性和效率。
实验流程包括样本制备、上样至10x Genomic单细胞捕获系统、构建cDNA文库并在Illumina测序仪上进行短读长NGS测序。数据通过Cell Ranger获得单细胞基因表达谱和差异分析，Loupe Browser提供可视化工具，使研究者能直观地分析基因表达模式、细胞类型、细胞簇和样本间的比较。
在技术原理方面，Gel Beads（凝胶微珠）在转录组测序中用于捕获细胞中的mRNA。每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列，用于标记获取的mRNA，实现细胞的单细胞水平分析。捕获和建库过程包括细胞裂解、Gel Beads释放引物序列，与mRNA进行逆转录，生成带有10x Barcode和UMI信息的cDNA，然后进行PCR扩增和酶切片段化，构建含有P5和P7接头以及双端index的3端表达谱文库。
测序深度选择需根据需求和成本权衡，首次测序量建议25k reads/cell，测序结束后用Cell Ranger初步分析，根据Sequencing Saturation数值判断是否需要加测。
数据分析包括使用Cell Ranger提取细胞的barcode和UMI，校正和过滤数据，提取单细胞数据，得到基因表达矩阵。后续使用Seurat进行细胞过滤、标准化、聚类、可视化等操作，以获得细胞聚类分型结果、Marker基因及差异表达基因信息。个性化分析包括KEGG/GO富集分析、蛋白质互作网络分析、基因网络共表达分析、拟时序分析、细胞通讯信息分析、转录因子调控分析等。
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