测定Km值的方法有：分光光度法、化学发光法、流式细胞仪分析法以及新型测定方法等。
分光光度法是一种经典的测定Km值的方法。这种方法利用酶促反应速率与底物浓度的关系来求解Km值。其操作简便，且灵敏度较高，适用于大多数实验室。
化学发光法是一种新型的测定Km值的技术。该技术基于酶促反应产生的化学发光信号进行检测，具有检测速度快、灵敏度高的优点。与传统的分光光度法相比，化学发光法在测定某些特定酶的Km值时更具优势。
流式细胞仪分析法在测定Km值方面也有应用。该方法结合了流式和荧光技术，可以实时监测细胞内酶的活性及底物浓度变化，从而准确求解Km值。这种方法尤其适用于研究细胞内酶的特性和功能。
此外，随着科学技术的进步，一些新型的测定Km值的方法正在不断发展。例如，基于生物传感器的测定方法、基于微流控技术的测定方法等，这些方法在测定Km值时具有更高的精度和便捷性，为酶学研究和药物开发提供了有力支持。
总之，测定Km值的方法多种多样，根据不同的实验需求和研究对象，可以选择合适的方法进行测定。随着科技的进步，相信未来会有更多新型的、更精确的测定Km值的方法出现。