打靶载体制备基因剔除小鼠采用什么原理

Question

如题所述

Answer 1

技术原理：
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。同源重组又称一般性重组或非特异性重组，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。
主要策略：
（一） 完全基因剔除的策略
在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS载体。借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，实行靶基因的完全剔除。
（二） 大规模随机基因剔除—基因捕获
利用基因捕获建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。此外用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
（三）精细突变的引入
人类疾病中许多是由于基因功能丧失引起的，也有许多是由于基因过表达或功能获得引起的。对后者就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型。为此，研究者发明了各种可以将诸如插入终止密码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法。
（1）打了就走策略，也称进退策略
（2）双置换法
（3）“标记和置换”法

（4） 利用Cre-LoxP系统引入点突变
主要流程：
首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
获得的带有特定修饰的突变动物提供给研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。