å¨ååæ°´å¹³ä¸æä¾ä¸ç§çº¯ååæ©å¢ç¹å®DNAç段çæ¹æ³.常å«æç®çåºå ,ç¨ä½å¤éç»æ¹æ³å°å®ä»¬æå
¥å
éè½½ä½,å½¢æéç»å
éè½½ä½,éè¿è½¬åä¸è½¬å¯¼çæ¹å¼,å¼å
¥éåçå¯ä¸»ä½å
å¾å°å¤å¶ä¸æ©å¢,ç¶ååä»çéçå¯ä¸»ç»èå
å离æ纯æéçå
éè½½ä½,å¯ä»¥å¾å°æå
¥DNAç许å¤æ·è´,ä»èè·å¾ç®çåºå çæ©å¢.
å
é(clone,clon)ä¸è¯æºäºå¸è
æKlon,åæ为æ æ¨çææ¡.å¨çç©å¦ä¸å
¶åè¯å«ä¹ç³»æä¸ä¸ªç»èæ个ä½ä»¥æ æ§ç¹æ®çæ¹å¼äº§çä¸ç¾¤ç»èæä¸ç¾¤ä¸ªä½,å¨ä¸åççªåçæ
åµä¸,å
·æå®å
¨ç¸åçéä¼ æ§ç¶,常称æ æ§ç¹æ®(ç»è)ç³»ï¼å
¶å¨è¯(clone,cloned,cloning)å«ä¹æå¨çç©ä½å¤ç¨éç»ææ¯å°ç¹å®åºå æå
¥è½½ä½ååä¸,å³ååå
éææ¯.
å°DNAç段(æåºå )ä¸è½½ä½DNAååå
±ä»·è¿æ¥,ç¶åå¼å
¥å¯ä¸»ç»è,åçéè·å¾éç»çå
é,æå
éçç®çå¯å为DNAåcDNAå
é两类.
cDNAå
éæ¯ä»¥mRNA为åææ,ç»ä½å¤å转å½åæäºè¡¥çDNA(cDNA),åä¸è½½ä½DNAååè¿æ¥å¼å
¥å¯ä¸»ç»è.æ¯ä¸cDNAåæ ä¸ç§mRNAçç»æ,cDNAå
éçåå¸ä¹åæ äºmRNAçåå¸.ç¹ç¹æ¯ï¼
â æäºçç©,å¦RNAç
æ¯æ²¡æDNA,åªè½ç¨cDNAå
éï¼
â¡cDNAå
éæçé,å 为cDNAåºä¸ä¸å
å«éç»æåºå çå
é,èä¸æ¯ä¸cDNAå
éåªå«ä¸ä¸ªmRNAçä¿¡æ¯ï¼
â¢cDNAè½å¨ç»èä¸è¡¨è¾¾.cDNAä»
代表æä¸åè²é¶æ®µè¡¨è¾¾åºæ¥çéä¼ ä¿¡æ¯,åªæåºå æåºæå
å«ä¸ä¸ªçç©çå®æ´éä¼ ä¿¡æ¯.
1.æ¹æ³ï¼
(1)DNAç段çå¶å¤ï¼å¸¸ç¨ä»¥ä¸æ¹æ³è·å¾DNAç段ï¼â ç¨éå¶æ§æ ¸é
¸å
åé
¶å°é«ååéDNAåæä¸å®å¤§å°çDNAç段ï¼â¡ç¨ç©çæ¹æ³(å¦è¶
声波)åå¾DNAéæºç段ï¼â¢å¨å·²ç¥èç½è´¨çæ°¨åºé
¸é¡ºåºæ
åµä¸,ç¨äººå·¥æ¹æ³åæ对åºçåºå ç段ï¼â£ä»mRNAå转å½äº§çcDNA.
(2)è½½ä½DNAçéæ©ï¼
â è´¨ç²ï¼è´¨ç²æ¯ç»èæè²ä½å¤éä¼ å å,DNAåç¯ç¶,大å°ä¸º1-200å碱åºå¯¹(kb).å¨ç»èä¸ä»¥æ¸¸ç¦»è¶
èºæç¶åå¨,å¾å®¹æå¶å¤.è´¨ç²DNAå¯éè¿è½¬åå¼å
¥å¯ä¸»è.å¨ç»èä¸æ两ç§ç¶æ,ä¸æ¯âç´§å¯åâï¼äºæ¯âæ¾é©°åâ.æ¤å¤è¿åºå
·æååéå°,æ转å,æä¸è³å¤ä¸ªéæ©æ è®°çç¹ç¹.è´¨ç²åè½½ä½ä¸è¬åªè½æºå¸¦10kb以ä¸çDNAç段,éç¨äºæ建åæ ¸çç©åºå æåº,cDNAåºå次级å
é.
â¡å¬èä½DNAï¼å¸¸ç¨çλå¬èä½çDNAæ¯åé¾,é¿çº¦49kb,约å«50个åºå ,å
¶ä¸50%çåºå 对å¬èä½ççé¿åè£è§£å¯ä¸»èæ¯å¿
éç,åå¸å¨å¬èä½DNA两端.ä¸é´æ¯éå¿
éåº,è¿è¡æ¹é åç»å»ºä¸ç³»åå
·æä¸åç¹ç¹çè½½ä½åå.λ载ä½ç³»ç»æéç¨äºæ建çæ ¸çç©åºå æåºåcDNAåº.
M13å¬èä½æ¯ä¸ç§ç¬ç¹çè½½ä½ç³»ç»,å®åªè½ä¾µè¢å
·æFåºå ç大è æè,ä½ä¸è£è§£å¯ä¸»è.M13DNA(RF)å¨å¯ä¸»èå
æ¯åé¾ç¯ç¶åå,象质ç²ä¸æ ·èªä¸»å¶å¤,å¶å¤æ¹æ³åè´¨ç².å¯ä¸»èå¯åæ³å«åé¾DNAçM13å¬èä½,åè½æ¹ä¾¿å°å¶å¤åé¾DNA,ç¨äºDNA顺åºåæãå®ç¹çªååæ ¸é
¸æ交.
â¢æ·æ¯(Cos)è´¨ç²ï¼æ¯ä¸ç±»å¸¦æå¬èä½DNAç²æ§æ«ç«¯é¡ºåºçè´¨ç²DNAåå.æ¯å¬èä½ï¼è´¨ç²æ··åç©.æ¤ç±»è½½ä½åå容é大,å¯æºå¸¦45kbçå¤æºDNAç段.ä¹è½è±¡ä¸è¬è´¨ç²ä¸æ ·æºå¸¦å°ç段DNA,ç´æ¥è½¬åå¯ä¸»è.è¿ç±»è½½ä½å¸¸è¢«ç¨æ¥æ建é«ççç©åºå æåº.
(3)DNAç段ä¸è½½ä½è¿æ¥ï¼DNAååä¸è½½ä½ååè¿æ¥æ¯å
éè¿ç¨ä¸çéè¦ç¯èä¹ä¸,æ¹æ³æï¼â ç²æ§æ«ç«¯è¿æ¥,DNAç段两端çäºè¡¥ç¢±åºé¡ºåºç§°ä¹ä¸ºç²æ§æ«ç«¯,ç¨åä¸ç§éå¶æ§å
åé
¶æ¶åDNAå¯äº§çç¸åçç²æ§æ«ç«¯.å¨è¿æ¥é
¶çä½ç¨ä¸å¯æ¢å¤åæ ·,æäºéå¶æ§å
åé
¶è½ç¶è¯å«ä¸å顺åº,å´è½äº§çç¸åæ«ç«¯.â¡å¹³å¤´æ«ç«¯è¿æ¥,ç¨ç©çæ¹æ³å¶å¤çDNAå¾å¾æ¯å¹³å¤´æ«ç«¯,æäºé
¶ä¹å¯äº§ç平头æ«ç«¯.平头DNAç段å¯å¨æäºDNAè¿æ¥é
¶ä½ç¨ä¸è¿æ¥èµ·æ¥,ä½è¿æ¥æçä¸å¦ç²æ§æ«ç«¯é«ï¼â¢åèå¯¡æ ¸è·é
¸æ«ç«¯è¿æ¥.â£äººå·¥æ¥å¤´ååè¿æ¥,å¨å¹³å¤´DNAç段æ«ç«¯å ä¸ä¸æ®µäººå·¥åæçãå
·ææä¸éå¶æ§å
åé
¶è¯å«ä½ç¹çå¯¡æ ¸è·é
¸ç段,ç»éå¶æ§å
åé
¶ä½ç¨åå°±ä¼äº§çç²æ§æ«ç«¯.
è¿æ¥ååºé注æè½½ä½DNAä¸DNAç段çæ¯ç.以λæCosè´¨ç²ä¸ºè½½ä½æ¶,å½¢æ线æ§å¤è¿ä½DNAåå,è½½ä½ä¸DNAç段çæ¯çé«äºä¸ºä½³.以质ç²ä¸ºè½½ä½æ¶,å½¢æç¯ç¶åå,æ¯ç常为1â¶1.
(4)å¼å
¥å¯ä¸»ç»èï¼å¸¸ç¨ä¸¤ç§æ¹æ³ï¼â 转åæ转æ,æ¹æ³æ¯å°éç»è´¨ç²DNAæå¬èä½DNA(M13)ä¸æ°¯åéå¤çè¿ç宿主ç»èæ··åç½®äºå°ä¸,å¾
DNA被å¸æ¶åéºå¨å¹³æ¿å¹å
»åºä¸,åæ ¹æ®å®éªè®¾è®¡ä½¿ç¨éæ©æ§å¹å
»åºçééç»å,é常éç»ååç转åæçæ¯ééç»DNAä½,åå æ¯è¿æ¥æçä¸é«,æ许å¤DNAååæ 转åè½å,èä¸éç»åçDNAååæ¯åè½½ä½DNAåå大,转åå°é¾.â¡è½¬å¯¼,ç
æ¯ç±»ä¾µæ宿主èçè¿ç¨ç§°ä¸ºè½¬å¯¼,ä¸è¬è½¬å¯¼çæçæ¯è½¬åé«.
(5)å
éçéæ©ï¼
â ç´æ¥çéï¼æäºè½½ä½å¸¦æå¯è¾¨è®¤çéä¼ æ è®°,è½ææå°å°éç»ååä¸æ¬åºåºå.ä¾å¦ï¼æäºÎ»å¬èä½æºå¸¦å¤æºåºå åå½¢æçå¬èæå°±ä¼ä»åæ¥çæ··æµå为æ¸
亮ï¼è¿æäºè½½ä½ååæºå¸¦å¤æºåºå å,å½¢æçèè½æå¬èæçé¢è²æææ¾åå,å¦èè²å为æ è²ï¼æäºÎ»å¬èä½è½ä¾µæç²èèä¸è½ä¾µæä¹è,æºå¸¦å¤æºDNAç段å便è½ä¾µæä¹è,å æ¤ä¹èéæ¾çå¬èä½å为éç»åå.
â¡é´æ¥çéï¼æå¼èµ·è½½ä½åå带æä¸ä¸ªæå¤ä¸ªæè¯æ§æ è®°åºå ,å½å¤æºDNAæå
¥å°æè¯åºå åºå,åºå 失活,ææ§æ¶å¤±.å¦ä¸è´¨ç²æAåB两个æè¯æ§åºå ,å½å¤æºåºå æå
¥å°Båºå åºå,便åªæAè¯èä¸æBè¯.å æ¤è½å¨Aè¯å¹å
»åºä¸æ£å¸¸çé¿èä¸è½å¨Bè¯å¹å
»ä¸çé¿ç便æ¯éç»åå.
â¢æ ¸é
¸æ交ï¼å¹¿æ³ç¨äºçéå«æç¹å¼DNA顺åºçå
é.æ¹æ³æ¯å°èè½æå¬èæâå°è¿¹âå°ç¡é
¸çº¤ç»´èçæ¯æç©ä¸,åæ§ååºå®å¨åä½,ç¶åä¸æ è®°çæ ¸é
¸æ¢éè¿è¡æ交.é³æ§ç¹çä½ç½®å°±æ¯æéè¦çå
é.
â£å
ç«å¦æ¹æ³ï¼å¦æéç»å
éè½å¨å®¿ä¸»èä¸è¡¨è¾¾,å°±å¯ä»¥ç¨ç¹å¼çèç½è´¨æä½ä¸ºæ¢é,è¿è¡åä½æ交,éæ©ç¹å¼çå
é.
2.éè¦æä¹ä¸åºç¨ï¼
ååå
éææ¯æ¯70年代æåå±èµ·æ¥ç,å®çåºç°ååºç¨å¼è¾äºååéä¼ å¦ç 究çæ°é¢å,æå¼äºäººç±»äºè§£ãè¯å«ãå离åæ¹é åºå ,åé æ°ç©ç§ç大é¨.å®çæ就对äºå·¥ä¸ãåç§ä¸åå»å¦äº§çæ·±è¿å½±å,并å°ä¸ºè§£å³ä¸çé¢ä¸´çè½æºãé£ååç¯ä¿ä¸å¤§å±æºå¼æä¸æ¡æ°çåºè·¯.
å¨å»å¦æ¹é¢,å©ç¨ååå
éææ¯å·²å°è°å²ç´ ,人ãçå鸡ççé¿æ¿ç´ ã人çå¹²æ°ç´ ãæ¾é©°ç´ ãä¿çº¢ç»èçé¿æ¿ç´ ãä¹åèçç
æ¯æååå£è¹ç«ç
æ¯æåçåºå å¶æå·¥ç¨è,å©ç¨åé
µå·¥ä¸è¿è¡äºå¤§è§æ¨¡ç产.è¿å¯æé«å¾®çç©æ¬èº«æ产ççèç½é
¶ç±»åæçç´ ç±»è¯ç©ç产é.
å¨åºå æ²»çæ¹é¢.éè¿éä¼ å·¥ç¨çå°çç»èå
·æé转为æ£å¸¸ç»èçå¯è½æ§,ä¾å¦SV40ç
æ¯å¼èµ·çå°é¼ è¿ç¤ç»è,å¨æ¸©åº¦é«æ¶å¯é转为æ£å¸¸ç»è.为治çåä¹³ç³è¡ç,ç¨å¸¦æ大è æèä¹³ç³æ纵åçλå¬èä½å»ææåä¹³ç³è¡çæ£è
ç离ä½å¹å
»ç»è,åç°è¿ç§ç»èçåä¹³ç³è·é
¶è¾¾å°äºæ£å¸¸æ°´å¹³,并确å®è½ä»£è°¢åä¹³ç³.
å¨å·¥ä¸ç产æ¹é¢,以ååå
éææ¯ä¸ºä¸»ä½çåºå å·¥ç¨ãç»èå·¥ç¨ãé
¶å·¥ç¨ååé
µå·¥ç¨,åè
ç´§å¯èç³»ã常综åå©ç¨.许å¤åå¦è¯åå¦ä¸ç¯é
¸ãå·±äºé
¸ãä¹äºéãç²éãç¯æ°§ä¹ç·ãä¹å¤´é
¸åæ°´æ¨é
¸çé½å¯è½å©ç¨ååå
éææ¯å¾å°äº§å.å¨ç¯å¢ä¿æ¤æ¹é¢,äººä»¬æ ¹æ®éè¦è¿è¡åºå æä½,å°æç§å¾®çç©çåºå 转å
¥å¦ä¸å¾®çç©,åé ä¸äºå¯¹æ害ç©è´¨é解è½åæ´å¼ºçæ°èç§,以å解工ä¸æ±¡æ°´ä¸çææ¯ç©è´¨.å¨é£åå·¥ä¸æ¹é¢,ç»èå¯ä¸ºäººç±»ç产æä»·å¼çèç½è´¨ãæ°¨åºé
¸åç³ç.
å¨åä¸ç产æ¹é¢,æ¤ç©éä¼ å·¥ç¨å¯¹æé«åä½ç©ç产éãå¹è²æ°çåä½ç©åç§æä¾äºå¯è½.æ许å¤å¤æºåºå 导å
¥æ¤ç©è·å¾æå.
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