感受态细胞(competent cell):理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。
1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀;Ca离子会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化,极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子(如Mn、Co)、DMSO或还原剂等物质处理,可使转化率提高100~1000倍。
2.将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激(90s),细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙,外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养,筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
总之Ca离子使DNA沉淀于细胞表面(类似真核转染的磷酸钙共沉淀),0-42℃的热冲击使得膜表面出现裂痕(很快会被自动修复-疏水作用)使得膜表面DNA被摄入。
大肠杆菌是格兰阴性,细胞壁就是肽聚糖+外膜(脂蛋白、脂质双层、脂多糖)
这种细胞壁结构除了作为内毒素使机体发热、白细胞增加之外(当然还可以为此细菌形态、耐药性、结合Mg2+维持离子平衡),与细胞膜出现裂痕吸收DNA并没有什么关系。