分子(DNA、RNA)样品的保存

如题所述

组织的采集:
通常用于测序的植物DNA材料采集时,应选择当年生、新鲜且幼嫩(近成熟)的健康组织,主要采集叶片,但也可根据实际情况采集其他组织或器官,如芽、花、果实和种子等。每份样品采集量应为3-5克(鲜重),若为叶片,其表面积不应小于50平方厘米(约等于成年人手掌面积)。为保持DNA材料的稳定性,建议将每份DNA材料分为两份进行保存。采集后,应将新鲜的植物DNA材料迅速放入液氮中,或使用带有冷藏功能的采集箱,直至运输回实验室。回实验室后,应将DNA材料存于液氮或-80℃超低温环境中,无需干燥,可长期保存(2年内需进行检查)。
组织的干燥保存:
在野外作业中,使用液氮或采集箱保存DNA材料可能不便,因此,干燥保存方法尤为重要。将新鲜的植物DNA材料置于柔软且透气性好的纸袋中进行干燥。此方法可防止植物叶片在干燥过程中因脆化而破碎,同时避免与硅胶混杂,减少样品间的交叉污染。如无此类纸袋,可使用塑料自封袋代替,但需将植物DNA材料与硅胶一同干燥。
对于易失水的植物DNA材料,应在野外采集后立即进行快速干燥;对于不易失水的植物遗传物质材料,可在采集后放置一段时间(直至叶片失水前),再进行干燥;对于难以用硅胶快速干燥的遗传物质材料,如较厚或具多浆的叶片或种子等,可将这些材料碎成小片(块)后用硅胶快速干燥。
快速干燥植物DNA材料的最佳方式是使用硅胶,它能在短时间内使植物材料快速脱水,且对DNA的损伤较小。硅胶有粉末状(直径为20~30Å)和变色硅胶(蓝色)两种类型,混合使用效果更佳。通常需放入足够的硅胶(使硅胶覆盖全部的遗传物质材料)进行快速干燥。
组织的保存:
植物组织在干燥处理后或除野外采集过程外,均需置于合适的环境中保存。理想的环境条件为温度(4-15℃)和湿度(相对湿度小于10%-30%)。如无相应保存条件,可在室温下保存,但需保持通风干燥的环境;植物DNA材料也可以在低温(-20℃)或超低温(-80℃)条件下保存,但需保持DNA材料的干燥状态。然而,在这些条件下,植物DNA材料(如叶片等)实际上很难长期保存。因此,保存总DNA是另一种策略。
总DNA的保存:
提取总DNA后,应检查其完整性、纯度、浓度和含量。植物总DNA的保存最佳状态为干粉形式。如以溶液形式保存,应用1 × TE缓冲液稀释,并确保TE缓冲液的pH值在8.0-8.5之间。植物总DNA的低温保存最佳条件为-80℃以下或液氮保存,无条件的情况下也可在-20℃保存。总DNA应避免频繁冻融,并建议每份样品保存3-5个样本。提取后保存的总DNA时限通常较长(超过两年),但若长期保存,每隔两年应进行抽测,对不符合使用要求的DNA进行更新。
RNA的保存:
由于RNA为单链分子,稳定性较差,极易降解,其主要降解原因是内源性核酸酶(RNAase)的作用,其在活体内的存在时间也不长。同时,外源性RNAase也不容忽视,如头发、灰尘、体液、塑料等均存在RNAase。因此,RNA的保存需极其谨慎,提取时应戴帽子、口罩、橡胶无菌手套,并在洁净、灰尘少的地方提取。从组织材料的采集开始,经运输与储存,包括实验的全过程,涉及到RNA的均需将其置于液氮中,以停止细胞生理生化过程,从而较长时间保存RNA。这意味着不仅组织材料需保存于液氮中,实验操作也需保证液氮充足供应。将样品保存于-80℃等均无法有效制止RNA的局部或完全降解。
细胞的保存:
细胞是DNA、RNA的载体,也构成了组织。当涉及专属的细胞学实验时,便需要特殊的方法对其保存,这往往是细胞工程的基础。例如,做单细胞克隆要求细胞具有活力。又如基于某些目的使用流式细胞术分析细胞,此时要确保细胞能够相互分离,通常要求细胞具有活性,糖在细胞内的累积会导致分析不准确。液氮的低温环境(-196℃)是目前最佳的冷冻保存温度,复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当,一般生物样品在-196℃下可保存十年以上。应用-80℃保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但随着冻存时间延长,细胞存活率明显降低。
不同层次的样品,需根据样品性质、实验目的、保存条件,综合分析,选择最适合的方法。目的样品是分子水平,就需从分子角度考虑组织的保存;细胞水平,则是从细胞角度考虑。不同层次对细胞的活性要求也不同。
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