经过大半生的艰苦耕耘，1578年(明万历六年)，一部详实而完备的医药巨典——《本草纲目》终于编写成功了，当时李时珍已是61岁的老人了。为了《本草纲目》的出版发行，他不顾年迈体弱，千里迢迢赶到当时全国出版业的中心南京奔走呼叫寻找出版者，但却未如愿以偿，最后只得惆怅回乡。直到1596年(万历二十四年)，《本草纲目》才在南京刊行，史称金陵版。但李时珍已与世长辞三年有余了。
《本草纲目》凡190余万字，52卷，整部书层次分明，条理井然，既是一部药典，又是一部医著和方书。不但纠正了以往历代《本草》中的谬误，还增加了374种新药。《本草纲目》还是一部名副其实的植物志，其中对植物的形态、培植、分类、鉴别等的记载清晰有条、生动易懂。李时珍把1000多种植物分为五部三十类，而且对每种植物的根、茎、叶、花、果实、种子等，都进行了详细的描述。对各种植物之间的区别也描写得十分细腻、准确和生动。
《本草纲目》对动物的研究也达到了相当高的水平，收载了水禽32种、园禽23种、林禽17种、山禽13种、家畜类28种、野兽类38种、鼠类12种、寓类怪兽8种。如此等等。
《本草纲目》还收载矿物276种，对许多金属和化合物的产地、形色、采掘、区分方法都做了精细的叙述。此外还详细阐述了化学药物的性能及蒸馏、升华、结晶、沉淀、烧灼等制作方法。
《本草纲目》刊行后，立即受到人们的欢迎，风靡全国，争相传阅。随着中外文化的交流，《本草纲目》先后传至日本、朝鲜、法国、德国等国家，陆续翻译成日、法、德、英、俄、拉丁等文字大量出版，深受世界各国重视。西方人称之为东方医学巨典。李时珍为中国及世界文明所做的贡献同《本草纲目》一起永远载入了史册。