转氨基作用实验报告如下。
一、实验目的
1、学习氨基酸纸层析的基本原理;2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
二、实验原理
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的a-耐酸j a-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用厂泛地存在于机体各组织器官中,是体内氮基酸代谢的重要途径。
氨基酸反应时均转化为氮酶催化,此酶催化氛基酸的a-氛基转移到另一a一酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化如下反应:a-酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸,本实验以丙氨酸和a酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后。
用纸层析法检查谷氨酸的出现以证明转氨基作用。纸层析属干分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相容,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动。
这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不同的组分彼此分离。
物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示:物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
三、实验材料与仪器
试剂:1、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。2、0.2mol/LNa2HP04溶液81ml与02mol/LNaH2P04溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。3、01mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0891克先溶1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中以10NNaOH仔细调至pH74后加磷酸盐缓冲液至100ml。
仪器:玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。
四、实验步骤:1、肝匀浆制备:取新鲜动物肝05克剪碎后放入匀浆器加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,迅速研成匀浆用上述缓冲液4.5ml混匀备用。2、酶促反应过程。
五、实验结果记录
六、实验讨论
可以看出,测定管上清液点样出现了两个色斑,根据Rf值的计算也可以看出,测定管中氨基酸发生了转氨基作用。
转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的途径之一。指的是一种α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的催化下,转移到α-酮酸的酮基上,生成相应的α-氨基酸;而原来的α-氨基酸则转变为相应的α-酮酸。
结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的α-酮酸。反应由转氨酶和其辅基磷酸吡哆醛催化。磷酸吡哆醛是维生素B6的衍生物。人体内最重要的转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶。它们是肝炎诊断和预后的指标之一。
以上内容参考:百度百科—转氨基作用