第1个回答 2017-03-31
酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为 0.1%-0.25%（活力 1:200 或 1:250），但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
温度 一般认为胰蛋白酶在 56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为 37℃，通常在 37℃进行消化比室温作用快。
pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时 PH 只能选用 7.6~8.0 之间，否则对细胞有损伤。
无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制时应采用无钙镁离子的 PBS 配制。
消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为 20 分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于 4℃过夜也可。
分离方法如下：
①过夜冷消化 将取得的组织用 Hanks 液洗三次，剪成碎块大小为 4 毫米左右，用 Hanks 液洗 2~3 次以除去血球和脂肪组织，再加入 0.25% 的胰蛋白酶，摇匀后放 4℃过夜，次日再用 Hanks 液洗涤，弃去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：
热消化多次提取 -- 将剪碎的细胞块加入 0.25% 胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。
冷消化多次提取 -- 方法同上，只是消化温度为 4℃。
先热消化后冷消化 -- 将组织块先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于 4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。
胶原酶（Collagenase）消化法
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用 PBS 和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度 200u/mL 或 0.1~0.3mg/mL. 此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。
经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。本回答被提问者采纳