在演奏二胡时，音准的精确与否直接关乎演奏的流畅性。定音是将内外两弦的音高固定，二胡普遍采用五度定音法。泛音在众多乐器中也常用于调弦，二胡也不例外。利用泛音校正五度定音，既能确保准确性，又能提升我们的辨音能力。
根据二胡的特性和共鸣效果，内弦音高通常在绝对音高“g—d‘”之间自由选择，外弦相应地定在“d‘一a’”范围内。例如，如果内弦定为“g”，则外弦为“d‘”，反之亦然。这样的定音范围能保持二胡音色的浑厚圆润与清澈明亮。
在伴奏歌唱时，除了保持二胡特色，还需考虑与歌手嗓音的配合。例如，为男低音伴奏，二胡音高应比歌手高一个八度。歌曲中的“调号”仅作参考，实际定音要根据歌手声区和音域。通常，使用歌手的最低音作为二胡内弦定音，有利于充分发挥其嗓音特色。
登台独奏或参加乐队合奏时，二胡的标准定音通常采用“D、A定音”，这是统一的规定。在选择乐器调弦时，务必考虑二胡的独特发音特点。
二胡定音的准确与否同演奏效果有很大关系，二胡采用五度定音，一般用泛音进行调弦，“D、A定音”是二胡的标准定音。