生物体内除了少数物质可以受激产生自发荧光之外, 大多数分子本身没有荧光, 必须借助于染色技术。常用的染色方法有以下几种。
孵育法
将样品浸泡于染色剂溶液中, 染料分子通过扩散作用进入细胞内, 与样品中的目的分子结合。这是应用比较多、也是最简单的方法, 在应用于经过固定处理的细胞结构染色时效果不错; 但是在活细胞染色时有时会因为细胞膜对染料的透性不够或染料分子太大而无法进入细胞内影响染色效果。
损伤导入法
这是应用难以自由透过细胞膜的大分子染料时常用的一类方法, 主要有显微注射法、电刺激穿孔导入法等, 利用各种手段在细胞膜上造成空洞以使染料进入细胞内。这类方法的主要优点是导入的成功率高、染料在细胞内的浓度有保证; 缺点是操作复杂繁琐、掌握起来有一定的难度, 不适合大量细胞的测定, 而且损伤处理可能会对细胞的生理活动造成影响。
转基因法
随着生物学的发展, 发现了一些生物体内存在着可以受光刺激产生荧光的蛋白质——发光蛋白, 如水母发光蛋白(能与细胞内游离钙离子结合)、绿色荧光蛋白等, 这些蛋白的基因已经被克隆出来用于制造转基因生物。除了可以直接将某些荧光蛋白的基因导入细胞表达外, 还可以把我们要研究的某些蛋白质的基因与这些荧光蛋白质的基因整合到一起, 使之一起表达合成并连接在一起, 共同存在于细胞内。对这些与目的蛋白结合在一起的荧光蛋白的荧光位置及强度进行分析, 可以获得目的蛋白在细胞内定位、在发育过程中表达合成的动态变化情况。目前可以用于显微注射的荧光蛋白、荧光蛋白基因、经过改造可供连接用的荧光蛋白基因片段乃至连接了荧光蛋白基因的某些目的蛋白基因都有商品出售, 大大方便了研究工作的开展。 样品经共聚焦显微镜观察得到图像及数据后, 图像和数据的加工处理 是一项关键技术, 也是耗时费力的一步, 各个共聚焦显微镜生产厂家一般都有配套的图像加工和数据处理软件, 用法各不相同。除这些软件外, 一些通用的图像加工和数据处理软件也是数据及图形加工处理过程中经常用到的。
