CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后

Question

如题所述

Answer 1

简单整理一下：
protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（一） https://www.jianshu.com/p/bfb34ba1050d
protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（二） https://www.jianshu.com/p/fb693b81748b

因为没看懂又中途跑去看了一波中文
CRISPR-Cas9学习笔记 https://www.jianshu.com/p/b9d2a7203e6c

差不多的时候，在师兄带领下，学习设计了一下sgRNA（讲真，这部分我真是什么都不懂，全靠师兄演示之后再自行补充背景知识）
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https://www.jianshu.com/p/8222f449cb44

此外，还有穿插学习的内容
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记 https://www.jianshu.com/p/ccae8b289cab
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing https://www.jianshu.com/p/a70e7c2b83d0

设计了sgRNA之后怎么办呢？？还是这篇文章

（1）首先是实验设计

详情见：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https://www.jianshu.com/p/8222f449cb44

sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。

A）PCR扩增的方法
U6：来源于人U6小核启动子，常用小RNA 表达，转录本为shRNA。
将sgRNA放到U6后面，利用U6的启动来扩增sgRNA。
将这部分内容整合到Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9表达质粒）中，一起共转。

B）sgRNA表达质粒的方法
现在我要用这个方法来举例

找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000 bp）

找到的序列如下：

将上面复制的序列粘贴到blast中 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像，问我是不是就用下面这个 。

选和不选我都试过了，选择的话，得到的引物有两对，如下（摘选了其中一个）：

如果不选的话

这个很好理解，在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后，可通过抗生素筛选或者FACS分离。

测序啦！

感谢师兄DZ