第1个回答 2022-07-19
质粒的抽提与纯化实质上是将质粒DNA与细菌的基因组染色体DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等细 胞器及其他大分子物质分离的过程，因此质粒的抽提大致可分为：细菌的培养、收集与裂解；质粒DNA 的分离与纯化；浓度、纯度的鉴定三个过程。
①染色体DNA的去除 ：在富集培养目标菌种后，首先应裂解细菌细胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒，同时氢氧化钠的强碱性，可使DNA氢键断裂，双螺旋结构破坏而变性，再加入中和缓冲液，可使部分变性的质粒DNA复性，而染色体DNA不复性，因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。
②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除
③蛋白质的去除 ：细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提，酚可以使蛋白质变性，氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中，使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收，乙醇可以消除核酸水化层，暴露其带负电的磷酸基团，因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀
④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。
⑤试剂盒法DNA的回收 :除碱裂解法以外，还可以通过试剂盒抽提质粒DNA，在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA，将其与其他杂志分离，而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。
⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定
电泳法 ：带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动，不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同，因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察，因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间，避免被凝胶中的氢离子淬灭，因而亮度更高。
紫外分光光度法 ：DNA的吸收峰在260nm处，蛋白的吸收峰在280nm处，因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度，一般认为比值在1.8~2.0之间时，纯度较高
材料：
含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液
试剂：
①细菌的培养：LB培养基、氨苄青霉素
②细菌的裂解与收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA、Glucose）、溶液II（NaOH、SDS）、溶液 III（KOAc、CH3COOH）、RNAseA
③质粒DNA的分离与纯化：酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl、 EDTA）、东盛生物小提质粒盒
④电泳：琼脂糖、0.5XTBE电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer
①细菌的培养：
将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中，震荡培养过夜
②细菌的收集与裂解
- 碱裂解法
吸取1.5ml菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)
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弃上清培养液 (完成细菌的收集)
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加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震荡混匀，静置2min (悬浮菌体、去除RNA)
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加入250ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒，此步骤动作轻柔，防止基因组DNA断裂，且时间不宜过长)
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加入180ul溶液III，颠倒混匀，冰浴10min （中和反应，防止基因组DNA污染）
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12000rpm离心5min，吸取上清80ul，重复此操作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)
③质粒DNA的分离
加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min，静置分层 （DNA在水相中），12000rpm 离心10min
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通风橱中吸取上清，加入20体积的无水乙醇 （发生核酸-乙醇沉淀）
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12000rpm离心5min,倒掉乙醇，短暂离心10s，用移液枪吸取乙醇
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加入500ul 70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心5min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸取乙醇，将其放置在通风橱中促进乙醇挥发
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加入300ul 1XTE溶解，65℃热板温育10min
④纯化质粒DNA
加入1XTE使溶液为300ul，加入300ul酚/氯仿，充分震荡抽提5min(去除蛋白)
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12000rpm离心5min，吸取上清
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加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀
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置于-70℃冰箱15min沉淀DNA
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4℃12000rpm离心15min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸去乙醇
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0.5ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，倒掉乙醇 （去除DNA中的盐离子）
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离心10s，移液枪吸去乙醇，在50-60℃热板上烘干1min
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加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育10min （使DNase失活）
-试剂盒抽提法
加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中，静置2min
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12000rpm离心1min，弃滤液 （DNA被吸附到硅胶膜上）
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加入500ul溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液 （洗脱蛋白、盐等杂质）
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加入500ul溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液 （重复此步骤一次，洗掉多余盐离子及乙醇）
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12000rpm离心3min （彻底去除纯化柱中残留的液体）
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将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent，室温静置2min （将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来）
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12000rpm离心1min （管底即为质粒DNA）
⑤琼脂糖凝胶电泳观察
制胶：
称取1.2g琼脂糖加入盛100ml 0.5XTBE电泳缓冲液的250ml 三角瓶中，摇匀
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微波炉加热至琼脂糖溶解（沸腾）
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放在冷水中冷却，加入10ul的StarGreen DNA Dye，摇匀
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琼脂糖倒入模具中，插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子，将凝胶转移到电泳槽中，加入0.5XTBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm
点样：
按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker（10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul）、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul，试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中，再分别加入10Xloading buffer，配置10ul点样体系，吹吸混匀
电泳：
打开电源开关，调节电压3-5V/cm
观察：
将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察