第1个回答 2022-07-31
电泳速度与DNA构象的关系
质粒DNA通常具有三种不同的构象：共价闭合环状（超螺旋）、线型、开环型（环状）.琼脂糖凝胶电泳时,一般共价闭合环状的迁移速度最快,其次为线状分子,开环型分子最慢。
核酸分子大小与琼脂糖浓度范围的对应关系
分子量大的核酸电泳时使用浓度较小的凝胶，分子量小的核酸电泳时使用浓度较大的凝胶。核酸在浓度越大的凝胶中电泳速度越小。如果胶浓度偏高，可能跑不动，如果胶浓度偏低，可能跑得太快，分不开。
凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp）
0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000
1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000
注意：核酸染料有毒，具有致癌性，注意保护自己。
电压关系
电压过高会因为发热导致胶融化，跑太长时间marker会跑出去，甚至污染电解液。电压看电泳槽多大，两电极之间的距离，每cm 3~5V。例如一个20cm的电泳槽，电压就应该设为60~100V间。电压大，速度就快。
拖尾
marker拖尾是因为缓冲液要换了或者缓冲液太少了没有盖住胶。
菌落PCR
1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。
2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。
退火温度是当50%的引物和模板表现为双链DNA分子时的温度.在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 DNA聚合酶在60-72度活性比较高。因此，退火温度是可以高于60度的。延伸的温度不要低于退火温度，一般72℃。