第1个回答 2024-08-10
什么是载体？
载体是基因工程中运送目的基因到生物细胞（受体细胞）的运载工具。其主要目的是为了分离、纯化以及表达特定的基因。在将外源基因送入受体细胞的过程中，需要依赖这种运载工具，这种运载工具就称为载体。
基因工程所用的载体是一类能自我复制的DNA分子。其中的一段DNA被切除而不影响其复制功能，可以被用来替换或插入外源（目的）DNA，从而将目的DNA带入受体细胞进行表达。这类载体主要包括质粒、噬菌体、病毒等。
载体的分类
载体按属性可以分为：
1. 病毒载体：常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞。
2. 非病毒载体：一般是指质粒DNA。
按进入受体细胞的类型可以分为：
1. 原核载体
2. 真核载体
3. 穿梭载体：含有原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达。
按功能分类，可以分为：
1. 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
2. 表达载体：这种载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA序列）有关的元件即成为表达载体。
按性质分：
1. 融合型载体
2. 非融合型载体
什么是质粒？具有哪些特征？
质粒通常被定义为圆形的、双链的染色体外DNA。我们知道，每个细胞都有一个细胞核或核区域，包含了细胞的所有遗传物质。但原核细胞和部分真核细胞，拥有额外的DNA，能独立于细胞染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。这个额外的DNA被称为质粒。它是双股的，通常是圆形的，这意味着它连接在一起形成一个圆。
天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围：1-300 kb。
质粒的自主复制性（可扩增性）：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，并根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1~3拷贝；松弛型复制控制的质粒 10~60拷贝，不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。
质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒——能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。非接合型质粒——不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。
携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性、物质合成等。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
为何质粒成为广泛应用的生物学工具？
质粒不仅仅是修饰细菌和酵母等生物，质粒也可以在正常的细胞分裂过程中随细胞一起复制，也可以自行复制。易于分离：很容易从宿主细胞中分离出来。质粒上可以进行特殊标记，十分利于筛选和鉴别。质粒存在重组DNA所需的某些区域，如复制起点(origin of replication)。质粒在尺寸上相比于基因组是很小的，它们相对来说更加易于研究和改造。
如何阅读一个完整的质粒图谱？
首先看质粒图谱包含的4大要素：
1. 复制起点(ori)：控制着质粒的复制，并决定了质粒的宿主属性和拷贝数；
2. 筛选标记：多为抗性基因，以便加以检测筛选；
3. 多克隆位点区：外源基因的插入位点；
4. 其他元件：如转录调控元件、翻译表达元件和蛋白标签等。
复制起点（Ori/origin）
图谱中的ori表示质粒的复制起点，ori及其控制的组分一起称为一个复制子。质粒的复制起点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，具有相同ori的质粒不可共转染（质粒的不相容性）。
筛选标记
图谱中的AmpR、KanR等表示质粒载体中的筛选标签，多为抗生素抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。只存在单抗性的质粒多为原核克隆载体和原核表达载体（例如T载体）。而存在两种或以上的抗性的多为穿梭质粒（如pcDNA3.1）。
多克隆位点区（Multiple Cloning Site，MCS）
是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒。多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。
其他调控元件
质粒载体中除复制起始位点、筛选标记、多克隆位点外，还具有其他一些表达或调控元件，如转录调控和翻译调控元件和融合表达标签蛋白等。
特殊元件或特殊序列
1. 启动子
启动子通常分为三类：组成型/广谱启动子，组织/细胞基因特异性启动子，诱导表达启动子。
2. 标签序列
标签，通常是相对较小的氨基酸序列。
3. Kozak序列
它是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。
4. poly(A) tail
poly(A) tail：真核生物mRNA的3’端都存在的一段序列，可以起到稳定mRNA的作用。
5. WPRE序列
WPRE是一段顺式作用的RNA元件，为转录后调控序列，放在多聚腺苷酸化信号之前可显著增加mRNA的表达水平和翻译效率，进而增强基因的表达，并且WPRE插入病毒载体中还可以大大提升病毒包装的滴度。
6. IRES序列
IRES元件非常有用，通常在双顺反子载体中应用最多。
完整观察一个质粒图谱
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如何改造一个质粒？
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。需满足以下改造原则：
1. 一般载体越小，转化的效率越高；小的载体外源DNA片段的装载量更大。因此，要删除天然质粒不必要的DNA区域，尽量减小质粒的相对分子质量。
2. 在质粒上引入含有多种限制酶切割位点的多克隆位点，以便外源基因的重组。一般还要删除重复的限制酶切割位点，使环状的质粒经限制酶处理后只在一处断裂，从而保证外源基因的准确插入。
3. 加入易于识别的选择性标记，如各种抗生素抗性基因，以便检测重组质粒是否成功进入受体细胞。
4. 为了保证实验的安全性，杜绝重组质粒扩散，污染环境，要灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌间转移的mob基因。为了提高质粒的拷贝数，还要灭活那些抑制质粒复制的基因。
5. 在质粒中引入特定用途的辅助序列，以满足更多的实验要求。例如，引入LacZ基因用于蓝白斑筛选；引入用于检测和分离表达产物的标签编码序列，如多聚组氨酸标签、由8个氨基酸组成的Flag-tag标签等。