第1个回答 2022-07-04
要进行shRNA载体构建，首先需要根据自己的基因，设计出对应的 靶点 、 loop序列 ， 酶切位点序列 ，详见 LncRNA的shRNA慢病毒载体引物设计 -
引物先用10000g在4°离心2min，再按照说明书的要求，加入DEPC或者无酶ddH2O将寡核苷酸稀释为100 μM。
按以下体系配制 退火反应体系 ：
无酶ddH2O补足 20 μl
正义寡核苷酸（100 μM） 2μl
反义寡核苷酸（100 μM） 2μl
10X T4 DNA连接酶缓冲液 1μl (这一步骤 可选，也可不加 ，直接加无酶ddH2O)
一般来说，把小体积液体往大体积液体中加，相对会更准确，所以答主一般先加ddH2O。
退火反应程序： 注意需要 缓慢退火
1. PCR法 ：将配制好的退火反应缓冲液重复混合，瞬时离心后放置在PCR仪上，先95℃ 4min，再70℃ 10min，然后在数小时内缓慢冷却至室温。运行以下程序：95℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min，10℃ 10min，4℃ ∞。
2. 沸水烧杯法 ：把tube放在在PCR仪或沸水烧杯中95°C孵育4分钟，4min后将烧杯从火焰中取出，并让水自然冷却至室温。
酶切体系：（这里用的是NEB的酶和buffer）
①无酶ddH2O 或DEPC：补足至30uL
②plasmid：体积=5ug/质粒浓度
③10X cutsmart：3uL
④限制性内切酶1：2uL
⑤限制性内切酶2：2uL
胶回收：
本组用的是 Omega gel extraction mini kit， E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit (V-spin) | Omega Bio-tek ，超详细步骤可见 过表达载体合成步骤 - 。
胶回收可以很大程度上 避免 DNA连接时发生 载体自连 的情况！
DNA连接体系：
双链DNA寡核苷酸：5uL
骨架plasmid：150~200ng/胶回收后的plasmid浓度
T4 DNA连接酶：2uL
T4 DNA连接酶buffer：2uL
ddH2O补足至20uL
16℃连接，过夜or 4小时均可
质粒转化：
取连接产物与30ul 感受态细菌（对于 慢病毒载体 ，最好选择 stable3菌株 ，更有利于质粒稳定；而对于原核表达的载体，最好选择Rosetta菌株）混匀后 冰浴30min ， 42℃热激90s ，立即置 冰上放置5min ,加入预热至室温的700ul LB培养基， 37℃恒温培养30min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根据骨架载体的特征来选，这里用的是pKLO.1质粒，因此选Amp）的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
1.在LB平板上挑出4~6个单克隆，加入LB培养基及筛选抗生素，37℃shake ，做质粒抽提。
2.测序验证
由于shRNA载体中的片段较小，一般只有几十个bp，因此，若要做双酶切验证，很可能看不到条带，直接做测序。