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NEB内切酶酶切时间
酶切
反应注意事项
答:
目前大多数研究者遵循一条规则,即10个单位的
内切酶
可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常,一个50μl的反应体系中,1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶,则可相应缩短反应
时间
;如果减少酶的用量,对许多酶来说,相应延长反应时间...
如何成功做好DNA
酶切
?如生物秀论坛这样的论坛还有哪些
答:
我一般用的是NEB公司的快切酶,就是酶后面带HF的(高保真),
说是切10多分钟就行
,但是有些酶会不怎么好用,我一般会切1h以上,如果没做过可以通过个预实验判断下,Takara公司的酶贵些,浓度也高些;如果是双切,两个酶切位点靠的比较近的话我一般会分布切,DNA酶切我觉得最主要两点:1。酶切...
酶切
反应中添加酶的量应控制在什么范围内
答:
我用的是NEB的快切酶,一般5U/ul的酶,我切1.5-2ng的质粒加2.5ul的酶量,
切一个小时左右就ok了
。当然如果实在切不开。可以适当减少质粒量(我切的是50ul体系)。
双
酶切
37℃一般切多久
答:
切割的时间可以根据实验需要进行调整,但一般情况下,
双酶切的反应时间为3-4小时
。这个时间足够限制性内切酶与目标DNA发生特异性的结合和切割反应。而对于某些特殊的酶或特定的实验要求,切割时间可能会有所不同。
限制性
内切酶
是什么?
答:
限制性核酸
内切酶
(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶. [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上.它能识别外源DNA并将其降解. [单位定义] 在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位. [性状...
限制性
内切酶
是什么?
答:
其中有30%是在
NEB
发现的。对具有未知特异识别序列的限制性
内切酶
的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时,也采用计算机分析已知的基因组数据,以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶,仍然有识别新位点的酶不断被发现。上世纪80年代,NEB开始克隆并表达限制...
1. 限制性
内切酶
对DNA进行
酶切
时,哪些因素会影响酶切反应的效果?
答:
(2)
时间
:合适,大多为1h,可过夜反应。(3)溶液体系:要求有稳定的pH环境。(4)盐离子浓度:不同的限制性
内切酶
对盐离子强度(Na+)有不同要求。(5)反应体积和甘油浓度:在进行
酶切
反应时,加酶的体积一般不超过总反应的10%,若加酶体积太大,甘油浓度过高,则会影响酶切反应。(6)DNA的...
核酸
内切酶
的操作步骤及应用
答:
(2)
酶切
反应 将病毒DNA用TE溶解为大约0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切缓冲液(50mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl pH7.8,10mmol/ L MgCl2,1mmol/L DTT),5μl DNA,2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA),用灭菌双蒸水补足至50μl,在振荡器上温和振荡几秒钟,然后稍稍离心...
两种酶的反应缓冲液不一样,做双
酶切
时如何处理?
答:
如果是分开
酶切
的话,第一个酶切完成后要回收(可用醇回收,效率比较高)后,再进行第二次酶切。做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见,一般连接3小时,16度;对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来...
什么是限制性
内切酶
?
答:
DNA为dNMP,RNA为NMP)。核酸
内切酶
(endonuclease):在核酸水解酶中,为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶,与核酸外切酶相对应。外切酶:即核酸外切酶(exonuclease )核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键,降解核苷酸的酶。
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